难梭菌感染（CDI）已成为全球重大公共卫生负担，其引发的伪膜性肠炎、中毒性巨结肠等严重肠道疾病，在欧美复发率高达 7.9%-35%、死亡率 4%-6%，我国 14 个地区 CDI 发病率达 11.4%，且存在显著的区域菌株差异（如中国南北地区优势菌株不同）。传统依赖甲硝唑、万古霉素等抗生素的治疗方案，虽能短期清除病原体，却会进一步破坏肠道菌群平衡，导致 20%-30% 的复发率，且耐药菌株持续涌现。益生菌作为肠道微生态调节剂，通过营养竞争、拮抗致病菌、修复肠屏障等发挥作用，其中乳酸菌是核心类别。屎肠球菌作为人体肠道固有菌群，可产乳酸及抗菌物质，但多数菌株缺乏系统表征，且区域菌株差异要求开发针对性益生菌。本研究聚焦筛选区域适配性抗 CDI 益生菌，从健康儿童粪便中分离鉴定出屎肠球菌 P2，通过体外 - 体内一体化实验，验证其安全性与功效，为 CDI 防治提供新选择。

研究团队从健康儿童粪便中分离出 4 株屎肠球菌（P1-P4），通过革兰氏染色、过氧化氢酶试验、16S rRNA 基因测序及特异性 Glup 基因鉴定，最终确定 P2 为目标菌株。安全性评估显示，屎肠球菌 P2 不携带 ace、gelE、clyA 等 6 种常见毒力基因，无 β- 溶血活性（γ- 溶血，安全性达标），且对万古霉素、氨苄西林、四环素、利福平在内的 9 种临床常用抗生素敏感，未检测到 vanA、vanB 等可传播耐药基因，符合益生菌安全标准。

采用琼脂扩散法与液体培养法验证发现，屎肠球菌 P2 的无细胞上清液（CFS）能显著抑制艰难梭菌 ATCC43255 生长，固体培养基上形成明显抑菌圈，液体培养中可显著降低艰难梭菌 600nm 处吸光度（OD 值），抑制效果优于 P1、P3、P4 菌株。此外，P2 还能强效抑制艰难梭菌生物膜形成，经结晶紫染色定量检测，共培养 72 小时后艰难梭菌生物膜量显著减少，提示其可阻断艰难梭菌的定植与耐药性形成。

益生菌需耐受胃酸、肠液及胆汁盐才能在肠道定植。实验显示，屎肠球菌 P2 在 pH3.0 的模拟胃液、pH8.0 的模拟肠液中培养 3 小时后仍保持高存活率；对 0.3% 和 1% 浓度的胆汁盐均表现出强耐受性，存活率显著高于益生菌筛选临界值。同时，P2 具备高细胞表面疏水性（H% 值优异）与自聚集能力，24 小时自聚集率达到较高水平，这些特性使其能有效黏附肠道黏膜，形成定植优势。此外，P2 在 pH6、pH8 等不同环境下均能形成稳定生物膜，进一步增强其肠道定植能力与抗逆性。

将 30 只 6-8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠分为阴性对照组（NC 组，给予 PBS）、CDI 模型组（CDI 组，仅感染艰难梭菌）、屎肠球菌 P2 预防组（P2 组，感染前 8 天每日口服 P2，10⁹ CFU/mL）。通过抗生素鸡尾酒预处理 + 克林霉素致敏 + 艰难梭菌感染构建 CDI 模型，持续观察 5 天，评估临床症状、组织病理及分子机制。

CDI 组小鼠感染后出现严重体重下降（3 天内显著降低）、精神萎靡、腹泻等症状，4 天内死亡率达 100%，平均临床评分（涵盖粪便性状、体重下降、刺激反应）持续升高至 5 天峰值；而 P2 组小鼠体重从第 4 天开始逐步恢复，死亡率较 CDI 组显著降低，平均临床评分在第 3 天达峰后持续下降，且全程低于 CDI 组。粪便菌落计数显示，P2 组在感染后 3-4 天艰难梭菌载量显著低于 CDI 组，证实 P2 能有效抑制肠道内艰难梭菌定植。

CDI 组小鼠结肠显著缩短，结肠黏膜出现严重糜烂、隐窝丢失及大量炎症细胞浸润；而 P2 组结肠长度较 CDI 组显著增加，组织病理显示黏膜结构基本完整，隐窝损伤减轻，炎症细胞浸润明显减少。此外，P2 组盲肠与脾脏重量异常升高的现象得到显著改善，提示肠道炎症反应被有效抑制。

肠道屏障损伤是 CDI 发病的关键环节。实验显示，P2 组小鼠结肠黏膜杯状细胞数量显著增加，黏蛋白分泌增多（AB-PAS 染色验证）；RT-qPCR 与免疫组化结果证实，P2 能显著上调肠黏膜紧密连接蛋白 ZO-1、Claudin-1 及黏蛋白基因 MUC-2 的表达，这些蛋白是维持肠道上皮完整性、阻止毒素入侵的核心分子，其表达上调可有效抵御艰难梭菌毒素（TcdA、TcdB）引发的肠屏障破坏。

CDI 引发的过度炎症反应是肠道损伤的重要原因。研究发现，P2 组小鼠脾脏重量较 CDI 组显著降低，结肠组织中促炎因子 IL-1β、MIP（巨噬细胞炎性蛋白）、COX-2（环氧合酶 - 2）的基因表达水平显著下调，而抗炎因子 IL-10 的表达水平显著升高，表明 P2 通过抑制促炎通路、增强抗炎反应，减轻肠道炎症损伤，促进黏膜修复。

肠道菌群失调是 CDI 发生与复发的核心诱因。16S rRNA 测序显示，CDI 组小鼠肠道菌群多样性显著下降（Shannon、Simpson、Ace 指数均低于对照组），致病菌所属的变形菌门、疣微菌门丰度升高，而有益菌所属的拟杆菌门、厚壁菌门丰度降低；给予 P2 干预后，肠道菌群结构显著改善，拟杆菌门、厚壁菌门丰度恢复，变形菌门等致病菌丰度被抑制。在科属水平，P2 组双歧杆菌科、毛螺菌科、普雷沃氏菌科等有益菌丰度升高，肠杆菌科、丹毒丝菌科等致病菌丰度降低，有效修复了 CDI 引发的菌群紊乱，形成抵御艰难梭菌定植的微生态屏障。

本研究首次系统证实，源自健康儿童粪便的屎肠球菌 P2 是一株安全、高效的抗 CDI 益生菌候选株。其优势在于：一是安全性经过严格验证，无致病风险与耐药性，适配临床应用需求；二是具备 “耐胃肠环境 - 定植 - 拮抗致病菌” 的完整益生菌特性，体外抑制效果显著；三是通过 “保护肠屏障 + 调节炎症 + 重塑菌群” 三重机制发挥抗 CDI 作用，靶点全面且协同；四是针对中国区域 CDI 菌株特点开发，适配性更强。相较于现有商业益生菌，屎肠球菌 P2 在抗艰难梭菌生物膜形成、区域特异性适配等方面具有独特优势，为解决 CDI 抗生素治疗的局限性提供了全新方案。未来需进一步开展临床研究，验证其在人体中的安全性与有效性，推动其成为 CDI 预防与治疗的新型益生菌制剂。

参考文献：Cui Y H, Jia Q Y, Yan H, et al. Novel Enterococcus faecium P2 as a probiotic for mitigating Clostridioides difficile infection[J]. Microbial Pathogenesis, 2025, 208: 108028. https://doi.org/10.1016/j.micpath.2025.108028