一、 文章简介

2021年，台湾大学研究团队发表于国际分子科学杂志《International Journal of Molecular Sciences》（IF：4.9，生物化学与分子生物学领域的Q1区期刊）上的一篇题为“Molecular Elucidation of a Urate Oxidase from Deinococcus radiodurans for Hyperuricemia and Gout Therapy”的研究论文，首次对来源于极端抗逆性微生物——耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans） 的尿酸氧化酶（命名为DrUox）进行了全面的生物化学与结构生物学表征。该研究聚焦于该酶的高催化效率与卓越的热稳定性，系统评估了其酶学性质、结构特征及稳定性，并论证了其在治疗高尿酸血症与痛风方面的巨大应用潜力。

二、 研究背景

在人类进化过程中，尿酸氧化酶基因发生伪基因化而失活，导致尿酸成为嘌呤代谢终产物。当血清尿酸水平超过饱和度（>6.8 mg/dL）时，会引发高尿酸血症，这是痛风、慢性肾病、心血管疾病及肿瘤溶解综合征等严重疾病的关键风险因素。然而，临床常用的降尿酸药物（如黄嘌呤氧化酶抑制剂和促尿酸排泄药），长期使用可能增加肾脏负荷。而尿酸氧化酶能直接将尿酸催化为溶解度高得多的尿囊素，从而实现快速、强效的降尿酸效果。已有重组尿酸氧化酶药物（如来自黄曲霉的Rasburicase和聚乙二醇化嵌合体的Pegloticase）获批用于临床，但其仍存在稳定性不足、免疫原性、疗效和成本等局限问题。因此，开发具有更高稳定性、更高催化活性的新型尿酸氧化酶是解决当前临床困境的有效策略。

三、 核心研究内容

本研究成功从德氏菌基因组中克隆出DrUox基因，并在大肠杆菌系统中实现高效异源表达。通过Ni-NTA亲和层析进行蛋白纯化，获得了高纯度的重组DrUox。生化分析证实其在天然状态下以同源四聚体形式存在（图1）。

图1 DrUox的生化和生物物理特性分析

A：经纯化DrUox的SDS-PAGE，如黑色箭头所示；

B：DrUox的分子筛色谱图（蓝线）。黑色箭头表示蛋白质标准的分子量 (Mw)与洗脱体积 (mL) 的关系。

DrUox 在原生状态下呈四聚体形式，计算分子量为 132 kDa

进一步，通过酶学表征，发现DrUox的最适反应温度为30°C，最适pH为9.0，此为尿酸氧化酶家族的典型特征。在生理条件下（37°C， pH 7.4），DrUox仍能保留90%以上的最佳活性，但其催化效率（Kcat/Km）相比最适条件（30°C， pH 9.0）下降了25倍，主要源于米氏常数（Km）的升高，表明其对底物亲和力在生理pH下有所降低（图2，表1）。

图2 温度和 pH 对 DrUox 酶活性和稳定性的影响

A：通过在 pH 9.0 下，将 0.5 M DrUox 和 500 μM 尿酸在 10°C 到 80°C 范围内孵育 3 分钟，评估最佳温度；

B：通过在 30°C 下，将 0.5 M DrUox 和 500 μM 尿酸在 pH 3.0 到 11.0 范围内孵育 3 分钟，评估最佳 pH；

C:在最佳条件下，通过将 DrUox 在 10°C 到 80°C 范围内预孵育 0.5 小时后，测定其温度稳定性；

D：在最佳条件下，通过将 DrUox 在 pH 3.0 到 11.0 的缓冲液中预孵育 24 小时（4°C）后，测定其 pH 稳定性

表1 DrUox 在生理和最佳条件下的稳态动力学参数

该科研团队还通过差示扫描荧光法 显示其四聚体解离温度（Tm1）为47.6°C，二聚体进一步解离温度（Tm2）为59.9°C。更重要的是，长期热稳定性实验 证明DrUox在25°C和37°C下孵育24小时后，活性几乎保持100%，展现了其优越的热稳定性（图3）。

图3 DrUox 差示扫描荧光测定的结果

除此之外，还研究了金属离子与化学试剂对DrUox的影响。发现Cu²⁺、Fe²⁺和Fe³⁺对其有显著抑制作用，而Mg²⁺能适度提升其活性。去垢剂、还原剂和H₂O₂对其活性影响较小，表明其结构稳健（图4）。

图4 各种金属离子和化学试剂对DrUox酶活性的影响

由于未能获得高质量的晶体，研究通过同源建模，以节杆菌尿酸氧化酶为模板，构建了DrUox的三维结构模型。质量评估表明该模型可靠。活性中心位于二聚体界面，由来自两个相邻亚基的残基共同构成，形成一个带正电荷的空腔。同时，通过序列与结构比对发现，其催化关键残基（如Thr70, Lys25, His262, Asn260）在尿酸氧化酶家族中高度保守。研究推断其催化机制可能涉及一个由水分子、Thr70和Asn260构成的“试剂钳”，以及由Lys25、Thr70和His262组成的“催化三联体”，负责在反应中进行质子转移。进一步证实其为典型的同源四聚体结构（图5）。

图5 DrUox 的结构模型

A：DrUox 原聚体模型的整体结构。DrUox 的结构以卡通模型显示，α-螺旋、β-折叠和环以石板色表示，DrUox 的二级结构用黑色标出。以绿色和橙色表示的区域分别代表二聚体和四聚体界面；

B：二聚体 DrUox 的顶视图。DrUox 的链 A 和链 B 分别以石板色和鲑鱼色显示。二聚体 DrUox 中的两个活性位点用虚线圆圈（橙色）标出。活性位点残基以棒状表示，碳原子为品红色；

C：左侧为四聚体 DrUox 的顶视图。右侧为四聚体 DrUox 的侧视图。DrUox 的链 A、链 B、链 C 和链 D 分别以石板色、鲑鱼色、黄色和青色显示。四聚体 DrUox 中的四个活性位点用虚线圆圈（橙色和绿色）标出；

D：DrUox-UA 模型中活性位点的立体视图。由二聚体 DrUox 提供的氨基酸以棒状表示，碳原子为黄色，并且以黑色标注。氧和氮分别以红色和蓝色表示。尿酸（UA）以棒状显示，碳原子为品红色

四、 结论与展望

本研究成功从极端微生物德氏菌中发掘并表征了一种新型尿酸氧化酶DrUox。该酶不仅具有高催化效率，更拥有在常温及生理温度下极其优越的热稳定性，这一特性使其在目前已报道的尿酸氧化酶中脱颖而出。其四聚体结构及保守的活性位点为其功能提供了结构基础。

五、展望

1.药物开发潜力：DrUox优越的稳定性意味着其作为蛋白药物，可能在储存、运输及体内半衰期方面具有显著优势，有望发展成为新一代治疗慢性难治性痛风和高尿酸血症的生物制剂；

2．蛋白质工程起点：DrUox其高稳定性的结构基础为后续的理性设计或定向进化提供了绝佳的初始模板，可通过蛋白质工程手段优化其在中性pH下的动力学参数，同时保持其稳定性优势；

3.诊断应用：除了治疗，稳定的尿酸氧化酶在临床诊断（如血清尿酸检测试剂盒）中同样需求巨大，DrUox的稳定性使其在此领域也具备应用价值。

总之，该研究不仅阐明了一个具有重要应用价值的新型酶分子，也为基于结构稳定性进行药物开发提供了新的候选分子和设计思路。

原文链接：https://doi.org/10.3390/ ijms22115611