2025年12月4日，美国国家科学院院刊PNAS在线发表了一项具有里程碑意义的研究成果《Recovery of infectious recombinant human norovirus using zebrafish embryos》，来自日本大阪大学的研究团队成功建立了基于斑马鱼复制系统的人源诺如病毒（HuNoV）反向遗传系统，这一突破性进展有望显著加速诺如病毒疫苗和抗病毒药物的研发进程。

HuNoV是全球胃肠炎的主要原因之一，且缺乏稳定的、可持续传播的复制体系，极大地限制了对病毒复制、致病性、抗病毒药物与疫苗的系统性研究。既往的包括在肠道器官样样本、B细胞/唾液腺相关细胞系以及啮齿动物模型中的传播与培养，都很难实现持续的体外全复制与基因组改造等研究。之前有学者尝试过基于质粒的HuNoV反向遗传体系，但感染性重组病毒的恢复及多代传代仍未被广泛认可。

该研究首次不借助培养细胞，直接通过斑马鱼胚胎实现HuNoV的cDNA复制子恢复。研究人员首先证实了斑马鱼胚胎能够高效支持诺如病毒的复制。通过将来自患者粪便的原始病毒注入斑马鱼胚胎，他们观察到GII.4和GII.17型病毒RNA在3天内呈现出104倍的增长，并且可以进行连续多次传代，这表明斑马鱼胚胎可以实现病毒稳定复制。

研究构建的两种复制子系统

1.基于T7 RNA聚合酶的细胞培养系统辅助方法

首先，研究人员将HuNoV的基因组cDNA克隆到质粒载体中，并在其前方引入T7启动子，后方连接核酶和T7终止子。随后，将该cDNA质粒与编码病毒包装的基因转染至表达T7 RNA聚合酶的哺乳动物细胞中。经过细胞培养，产生的病毒颗粒被浓缩并注入斑马鱼胚胎。结果表明，这种方法能够成功复苏具有感染性的重组HuNoV，并可在斑马鱼胚胎中进行复制和传代。

图1 基于T7 RNA聚合酶的细胞培养系统辅助方法

2.cDNA直接注射斑马鱼胚胎

为了进一步简化和提高效率，研究团队直接将T7启动子替换为在斑马鱼研究中常用的多聚酶II启动子。随后，将构建好的Pol II启动子驱动的cDNA克隆直接注射到单细胞时期的斑马鱼胚胎中。这种方法无需依赖任何体外细胞培养，直接在斑马鱼胚胎内部实现了重组病毒的复苏和复制。并且，通过5' RACE技术验证，该方法并未在病毒基因组的5'端引入多余的核苷酸序列，确保了病毒的正常复制。

图2 cDNA直接注射斑马鱼胚胎

研究人员成功在重组病毒的NS4基因中插入了一个小型的HiBiT标签，该标签可以通过发光反应进行高灵敏度的检测。发光强度可以直接反映病毒的复制水平。此外，还通过基因工程技术，成功构建了GII.4基因型的VP1蛋白嵌合到GII.17基因组骨架中的重组病毒，免疫印迹确认GII.4 VP1与GII.17 VP2的表达。这使未来能够深入研究不同基因型病毒的VP1蛋白在病毒复制、感染中的作用。

这项研究，实现了HuNoV反向遗传系统技术上的巨大突破，该该复制子系统有望显著提升抗病毒药物的筛选效率、降低成本、缩短研发周期。此外，还会为 HuNoV 的多价疫苗设计和筛选提供基础，也为其他难以在体外培养的病原体研究提供了新的思路。

参考文献：

Kotaki T, Akieda Y, Chen Z, Onishi M, Komatsu S, Motooka D, Omori H, Tamiya S, Kanai Y, Minami S, Kawagishi T, Sakon N, Sato S, Ishitani T, Kobayashi T. Recovery of infectious recombinant human norovirus using zebrafish embryos. Proc Natl Acad Sci U S A. 2025, 9;122(49):e2526726122. doi: 10.1073/pnas.2526726122