1.引言

食源性致病菌如单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌对全球食品安全构成重大威胁，尤其对孕妇、儿童及免疫力低下人群危害严重。传统的培养法虽为检测金标准，但耗时长、劳动强度大且易出现假阴性，难以满足现代食品工业快速检测的需求。尽管实时荧光定量PCR技术已广泛应用，但现有的多重检测方法往往灵敏度不足或成本高昂。鉴于肉类制品（特别是短保质期产品）中这两种病原菌的检测对监管和出口至关重要，迫切需要开发一种快速、灵敏且经济的联合检测方法，以提高食品安全监控效率。

本研究开发了一种双重qPCR-HRMA技术，通过优化引物浓度、退火温度及熔解速率，解决了传统方法及现有PCR技术在同时检测单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌时存在的耗时长、灵敏度不足或成本高昂的问题。在试验方法上，研究针对两种菌的保守基因（prfA和STM4497）设计特异性引物，利用SYBR Green染料在CFX-96系统上建立双重实时PCR体系，并结合高分辨率熔解曲线分析进行产物鉴定。通过对反应体系中引物浓度（如LM引物500 nM，ST引物50 nM）和退火温度（56℃和60℃）的精细梯度优化，以及对熔解速率（0.04℃/s）的标准化，确保了双重扩增的特异性和分辨率。此外，研究还结合了毛细管电泳验证产物大小，并依据ISO 22118:2011标准进行了包括反应灵敏度、方法灵敏度、稳健性及能力验证在内的全面方法学验证。

2.结果与讨论

毛细管电泳验证扩增片段大小与特异性：利用QIAxcel高级毛细管电泳系统对双重qPCR扩增产物进行分离检测，通过比对绝对迁移时间与标准Marker，验证扩增产物的特异性与大小，结果显示单增李斯特菌（LM）产生147 bp、鼠伤寒沙门氏菌（ST）产生118 bp的特异性条带，且无非特异性扩增或引物二聚体干扰，确证了引物设计的特异性。

图 1 毛细管电泳评估用于验证双重qPCR-HRM测定中扩增产物的尺寸。展示了电泳运行的图像（1a）和产物的绝对迁移时间（1b）。118碱基对和147碱基对的产物分别确认了S. typhimurium和L. monocytogenes的存在。

双重检测体系的熔解特征与聚类分析：利用Precision Melt分析软件对标准菌株进行高分辨率熔解分析，通过标准化熔解曲线与差值曲线，建立温度曲线图（Temperature Curve Chart）与差值曲线图（Difference Curve Chart），结果显示单增李斯特菌（LM）熔解峰约为76℃，鼠伤寒沙门氏菌（ST）约为80℃，双重检测呈现双拐点特征，且不同样本在聚类分析中呈现不同颜色簇（Cluster），实现了两种病原菌的同步鉴别。

图 2 温度曲线图（A）和差曲线图（B）展示了单核细胞增生链锥菌和伤病菌单胞菌与双链菌检测的区分。蓝色簇——单纯形检测到伤毛球菌（熔点80℃）;绿色簇——单纯形检测单核细胞增生（L.monocytogenes）（熔点76℃）;红色簇——单核细胞增生菌和S.typhimurium的双重检测。差异可通过温度曲线图中的拐点（箭头显示）、差曲线图中的曲线形状差异以及两张图表中的簇颜色（前述）来识别。

熔解速率对双重检测分辨率的优化研究：通过对比不同熔解速率（0.04℃/s、0.1℃/s、0.2℃/s）下的熔解曲线形态，评估其对双峰分离效果的影响，结果显示0.04℃/s的低熔解速率能获得最平滑的熔解曲线和最清晰的双峰分辨效果（双拐点明显），而速率过高（0.2℃/s）会导致分辨率下降无法区分双峰，从而确定了0.04℃/s为最佳检测参数。

图 3 熔解曲线分析和不同熔解速率下的高分辨率熔解分析，（A）熔解速率为0.04°C/s，（B）熔解速率为0.1°C/s，（C）熔解速率为0.2°C/s。在（C）0.2°C/s的熔解速率下观察到两种病原体的分辨率明显下降（峰值较小）。（A）熔解速率0.04°C/s和（B）熔解速率0.1°C/s提供了良好的分辨率，并可辨识出针对研究中使用的两种病原体特异性的双峰。（A）提供了最佳分辨率，如熔解曲线中更平滑的熔解剖面和高分辨率的熔解剖面。

双重qPCR-HRMA方法的检测限测定：利用梯度稀释的基因组DNA（20 ng至0.0002 ng）进行扩增与熔解分析，通过观察温度位移熔解曲线与差值曲线中双拐点的出现情况，测定方法的反应灵敏度，结果显示该方法在DNA加样量低至0.002 ng（约124-100拷贝）时仍能稳定检出双峰信号，确定了双重检测的最低检测限。

图 4 高分辨率熔体分析用于确定反应灵敏度。（A）标准化温度曲线图，显示红色簇中双重检测的双转折点;（B）温度偏移差曲线图，观察到熔融曲线形状和颜色差异（红色簇—双转折点反应，同时检测到76°C的单核细胞增生菌和S.typhimurium）在80°C下，最多可稀释五次）。在第六个稀释序列中仅检测到蓝色簇，表明反应足够灵敏，能检测到第五个稀释序列前的两种病原体。

3.总结

本文建立的双重qPCR-HRMA检测技术具有高特异性、高灵敏度与实用性强等显著优势。该方法针对单核细胞增生李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌设计特异性引物，结合高分辨率熔解曲线分析，可在同一反应中准确鉴别两种病原菌，避免交叉反应，检测限低至1.77 CFU/反应。通过优化引物浓度、退火温度及熔解速率，显著提升了检测的稳定性和分辨能力。实际样本验证显示其与商业系统结果一致，适用于肉类等食品基质，为食品安全监管提供了一种快速、准确、低成本的双重检测新方案。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2025.143245