在食品安全领域，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）作为一种常见的食源性病原体，长期威胁着人类健康。该菌尤其特殊的是，在环境压力下可进入“可存活但不可培养”（Viable but Non-Culturable, VBNC）状态，逃避传统培养法的检测，导致假阴性结果，加剧食品安全风险。近期，发表于《LWT-Food Science and Technology》的一项研究提出了一种创新解决方案——噬菌体扩增辅助的CRISPR/Cas12a检测技术（PAA-CRISPR/Cas12a），成功实现了对VBNC状态单核细胞增生李斯特菌的高灵敏、高特异性检测。这一突破为食品病原体监测提供了新思路，兼具科学严谨性与实际应用价值。

背景：VBNC状态的挑战与检测困境

单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性菌，广泛分布于自然环境中，可通过污染即食食品、生鲜农产品等途径感染人类，引发李斯特菌病。该病原体可穿越血脑屏障和胎盘屏障，导致脑膜炎、败血症甚至流产等严重后果。尽管发病率较低（每年每百万人0.1-11.3例），但其死亡率高达14.9%-25.9%，对孕妇、新生儿和老年人等易感群体构成显著威胁。

更棘手的是，单核细胞增生李斯特菌具备极强的环境适应性。它能在低温（0-10°C）下繁殖，对冷链食品构成风险；还能在压力环境下进入VBNC状态。VBNC细胞虽失去在常规培养基上生长的能力，但保持代谢活性和毒力，一旦环境适宜可能复苏，引发持续性污染。研究表明，约45%的孕妇李斯特菌感染病例血培养结果呈阴性，可能与VBNC状态相关。传统培养法作为“金标准”，需5-7天时间，无法检测VBNC细胞，且流程复杂、耗时长，难以满足现代食品工业对快速、高通量检测的需求。

创新方法：噬菌体与CRISPR/Cas12a的强强联合

本研究首次将噬菌体识别与CRISPR/Cas12a系统结合，开发了PAA-CRISPR/Cas12a检测平台。该方法的核心在于利用噬菌体对活菌的特异性感染能力，以及CRISPR/Cas12a的核酸信号放大功能，实现对单核细胞增生李斯特菌的活菌鉴别和定量检测。

噬菌体作为生物识别元件：研究选用李斯特菌噬菌体vB-LmoM-NJ05，该噬菌体分离自中国江苏养猪场，对单核细胞增生李斯特菌的主要致病血清型（1/2a、1/2b、4b）具有广泛裂解能力，对42株测试菌株的裂解率达70%。噬菌体通过尾纤维蛋白与细菌表面受体结合，实现特异性吸附和裂解，且仅感染活菌，从而有效区分活死细胞。

CRISPR/Cas12a信号放大：CRISPR/Cas12a系统通过crRNA引导识别靶标DNA，激活其反式切割活性，切割荧光标记的ssDNA报告分子，产生可检测信号。本研究针对噬菌体vB-LmoM-NJ05的尾纤维和衣壳蛋白基因设计特异性引物和crRNA，通过PCR预扩增和CRISPR/Cas12a反应，实现双重信号放大。

方法流程包括：

噬菌体与细菌共培养，利用噬菌体裂解宿主细胞释放子代噬菌体；

热裂解释放噬菌体DNA，经PCR扩增；

CRISPR/Cas12a系统检测扩增产物，通过荧光信号定量。

优化后的共培养时间为8小时，Cas12a和crRNA浓度均为25 nM，平衡了检测速度与灵敏度。

图1 PAA-CRISPR/Cas12a测定及条件优化。（A）五对引物性能的琼脂糖凝胶电泳分析。（B）基于五对引物和crRNA的CRISPR/Cas12a系统建立。（C）不同浓度vB-LmoM-NJ05基因组DNA的CRISPR/Cas12a检测荧光强度曲线。（D）不同浓度Cas12a和crRNA（Cas12a:crRNA比例1:1）用于检测10^8 CFU/mL单核细胞增生李斯特菌的荧光强度曲线。（E）10^1 PFU/mL vB-LmoM-NJ05噬菌体与10^4 CFU/mL单核细胞增生李斯特菌NJ05（MOI=0.001）共培养16小时的一步生长曲线。（F）不同共培养时间下，10^8 PFU/mL vB-LmoM-NJ05和10^8 CFU/mL单核细胞增生李斯特菌NJ05的PAA-CRISPR/Cas12a测定荧光强度曲线。

关键结果：高灵敏度、特异性与VBNC检测能力

该方法在纯DNA和细菌检测中均表现出卓越性能。对纯DNA的检测限低至4.16 × 10^1 copies/mL，在10^1至10^3 copies/mL范围内呈现良好线性（y = 4895x + 7690, R² = 0.985）；对单核细胞增生李斯特菌NJ05的检测限为3.1 × 10^1 CFU/mL，显著优于传统方法。

特异性测试显示，该方法仅对单核细胞增生李斯特菌产生信号，与沙门氏菌、大肠杆菌等常见食源性病原体无交叉反应，证实其高特异性。此外，该方法成功检测到VBNC状态细菌：通过FeSO₃诱导单核细胞增生李斯特菌进入VBNC状态，结合荧光染色验证后，PAA-CRISPR/Cas12a仍能有效检测，凸显其活菌鉴别优势。

图2 检测限。（A）质粒pUC57-crRNA的琼脂糖凝胶电泳分析。（B）不同质粒拷贝数下PAA-CRISPR/Cas12a测定生成的荧光强度曲线。（C）PAA-CRISPR/Cas12a测定终点荧光值与质粒浓度对数值之间的线性关系。（D）纯培养中不同浓度单核细胞增生李斯特菌的PAA-CRISPR/Cas12a荧光强度曲线。 

在实际应用方面，研究在人工污染的生菜样品中验证该方法，检测灵敏度达5.0 × 10^1 CFU/mL，且通过DNase I和蛋白酶K处理降低背景噪声，提升信噪比。这表明该方法在复杂食品基质中仍具鲁棒性，适用于现场快速检测。

图3 PAA-CRISPR/Cas12a检测单核细胞增生李斯特菌的特异性。评估包括使用阴性对照样品：无模板对照（NTC，含DEPC处理水）和不含单核细胞增生李斯特菌的阴性对照（NC）。ns表示P值 > 0.5；****表示P值 < 0.0001。

讨论：技术优势与未来展望

PAA-CRISPR/Cas12a方法的创新性在于融合了噬菌体的生物识别能力与CRISPR技术的高灵敏度，克服了现有检测方法的局限。与qPCR相比，CRISPR/Cas12a反应时间仅20分钟，无需复杂设备；与免疫学方法相比，其核酸级联放大机制提升了准确性。此外，噬菌体介导的活菌检测避免了PMA-qPCR中染料成本高、操作繁琐的问题。

然而，该方法目前需8小时共培养阶段，以完成噬菌体裂解循环和DNA扩增。未来研究可通过筛选裂解周期短、宿主范围广的噬菌体，或构建噬菌体鸡尾酒制剂，进一步缩短检测时间。同时，整合等温扩增（如RPA、LAMP）或微流控芯片技术，可简化操作，实现便携式检测设备的开发。

图4 可存活但不可培养（VBNC）细菌的检测。（A）不同浓度FeSO4诱导下VBNC状态单核细胞增生李斯特菌NJ05的斑块形成模式。（B）VBNC状态单核细胞增生李斯特菌NJ05的荧光显微镜图像，碘化丙啶（PI）染死菌为红色，荧光素二乙酸酯（FDA）染活菌为绿色。（C）PAA-CRISPR/Cas12a测定检测VBNC状态单核细胞增生李斯特菌NJ05的荧光强度曲线。

在应用层面，该方法不仅适用于食品监测，还可扩展至临床诊断和环境监测领域。例如，对水源中VBNC病原体的检测可预防公共卫生事件。此外，通过基因组分析设计保守序列crRNA，可提升对噬菌体不敏感菌株的检测能力，增强方法普适性。

图5 不同浓度加标生菜样品的PAA-CRISPR/Cas12a荧光强度曲线。本分析展示了PAA-CRISPR/Cas12a测定对加标不同浓度目标细菌的生菜样品生成的荧光强度曲线。

结论：迈向精准食品安全监测的新台阶

本研究开发的PAA-CRISPR/Cas12a检测技术，通过噬菌体与CRISPR系统的协同作用，实现了对单核细胞增生李斯特菌（包括VBNC状态）的高效检测。其检测限低至31 CFU/mL，线性范围宽，且具备活菌鉴别能力，为食品安全生产提供了可靠工具。未来，通过技术优化与多学科融合，这一策略有望成为病原体检测的标杆方法，助力全球食品安全防护网络的构建。

总之，这项研究不仅解决了VBNC状态细菌的检测难题，更展示了生物识别与分子放大技术结合的广阔前景。在食源性疾病频发的当下，此类创新技术将深刻影响公共卫生策略，推动检测科学向更快速、更精准的方向发展。

参考文献：Shen Y, Bai M, Zhu N, et al. Integrating Phage Recognition and Ultrasensitive CRISPR/Cas12a for Breakthrough Detection of Viable-but-Non-Culturable Listeria monocytogenes[J]. LWT, 2025: 118964.