氯霉素（CAP）作为一种广谱抗生素，其在食品与环境中的残留会对人体健康造成潜在风险，因此许多国家已对其在食用动物中的使用实施严格禁令。然而，由于CAP价格低、抑菌效果好，非法使用或环境污染仍可能导致其在牛奶、蜂蜜及水产组织等样品中被检出，给食品安全监管带来持续压力。目前常用的HPLC、LC-MS与ELISA等检测方法虽较为成熟，但普遍存在成本高、流程复杂、依赖专业仪器等局限，难以满足现场快速筛查与常态化监测的需求，因此亟需开发快速、灵敏且成本可控的新型检测策略。近年来，基于适配体的电化学、荧光、比色与拉曼等生物传感方法受到关注，其中分裂适配体因其“目标触发重组”的识别机制，能够在目标存在时促使两段序列重组形成稳定结构并输出信号，相比完整适配体可通过“双重识别”显著降低假阳性并提升抗干扰能力。但分裂适配体的关键难点在于分裂位点的选择，需在不破坏关键结合位点的前提下保证片段能高效复性并保持高亲和力与特异性。分子动力学（MD）模拟可通过结合自由能、RMSD、RMSF与氢键等指标解析结合机制并指导适配体优化，尽管既往已有MD指导结构预测、截短与修饰的研究，但将MD用于系统性指导适配体分裂并进一步构建双模式传感平台的工作仍相对缺乏。此外，单一信号输出的传感器容易受到复杂样本基质与外界环境干扰，从而影响检测准确性与灵敏度；相比之下，双模式传感可整合两种互补的读出方式，实现信号交叉验证，提升结果可靠性并拓展复杂环境下的应用范围。

基于此，本研究引入具有淬灭特性与类过氧化物酶活性，并可通过ssDNA非特异吸附调控其催化界面的ZIF-67纳米花（ZNF）材料，并结合DNA模板银纳米簇（AgNCs）作为荧光信号单元，在分子动力学指导下将CAP适配体理性分裂为两段以构建目标触发的组装体系：当样品中不存在CAP时，两段分裂适配体难以形成稳定杂交结构，AgNCs荧光维持在较低水平，同时体系中游离的单链DNA倾向于吸附在ZNF表面并抑制其对TMB的催化显色过程，其本质是TMB与DNA磷酸骨架相互作用并在催化界面附近形成DNA/TMB复合体，从而抑制催化反应，导致比色信号较弱；当CAP存在时，其与两段分裂适配体特异结合并诱导形成AgNCs@Split-a/CAP/Split-b夹心复合物，一方面使AgNCs荧光显著增强，另一方面由于游离DNA被消耗而削弱对ZNF表面的占据效应，从而恢复其类过氧化物酶活性并促进TMB氧化显色增强，最终通过同步采集626 nm荧光与652 nm吸收实现荧光与比色双模式交叉验证（图1）。

为验证该分裂策略的必要性与平台可行性，研究进一步通过关键碱基单点突变对照实验证实：分裂适配体的识别与组装严格依赖关键位点，任一关键碱基的突变均会显著削弱CAP触发的信号响应，从而证明MD指导的理性分裂设计是必要且有效的。同时，在加入0.5 ng/mL CAP后，荧光发射与比色吸收同步增强，并分别在紫外与可见光下呈现清晰可辨的差异，表明该体系能够将CAP诱导的夹心组装稳定转化为"荧光+显色"双通道可读信号（图2）。在此基础上，荧光与比色两种模式在优化条件下均建立了稳定的定量响应，检测限分别达0.011 ng/mL和0.021 ng/mL，体现了对痕量CAP的高灵敏检测能力。此外，体系表现出良好的重复性、选择性与储存稳定性：在1 ng/mL CAP条件下，荧光与比色测定的RSD分别为4.11%与4.98%（n=11）；对高浓度干扰抗生素（四环素、新霉素、卡那霉素、链霉素、妥布霉素）仍保持低响应，其中CAP为1 ng/mL，干扰抗生素为10 ng/mL；储存20天后荧光与比色信号仍保持约91.19%与92.98%。这些特性综合验证了该双模式平台在复杂基质快速筛查中的可靠性与应用潜力（图3）。

总之，本研究的核心创新在于：以分子动力学解析为先导，锁定关键结合碱基（G8、A9、G11、G28、T29、G31）并据此理性确定分裂位点，其中DG11因结合能最突出（-4.0 kcal/mol）且极性相互作用贡献最大而成为关键中的关键，从源头提升了分裂适配体的可重组性与识别可靠性；同时将DNA模板AgNCs荧光读出与ZIF-67类过氧化物酶催化显色读出耦合，实现同一识别事件的双通道交叉验证，从方法学层面增强了复杂基质检测的稳健性与可解释性，体现出计算指导分子设计与多模态信号输出协同的普适价值。与此同时，该体系仍存在一定局限性，例如双模式读出通常依赖特定光学采集条件与反应环境控制，材料与纳米簇的批间一致性、长期储存与现场温湿度波动下的信号稳定性仍需系统评估，复杂真实样本中潜在共存物与基质效应可能带来非特异影响，且现阶段验证多基于加标体系，距离规模化、标准化应用仍有验证链条需要补足。未来可围绕便携化与工程化方向推进，例如将体系固相化为试纸条或微流控芯片并引入手机端成像定量，实现无需专业仪器的现场读数，进一步通过比值型或内标校准增强抗环境漂移能力，优化样品前处理以适配更多食品与环境样本，并开展更大规模的真实样本对照与方法学标准化验证，同时将MD指导的分裂适配体设计框架拓展到其他兽药残留或多重靶标的多重检测场景，从而推动该策略从概念验证走向可推广的应用平台。

图1  基于分子动力学的关键碱基分裂策略及分裂适配体双模式检测原理。(A) 分子动力学解析定位 CAP 适配体关键结合碱基，并据此设计分裂方案，使关键位点分布在两段序列上以保留识别能力。(B) 无 CAP 时两段难以稳定杂交，AgNCs 荧光弱且游离 ssDNA 吸附抑制 ZNF 催化 TMB 显色；加入 CAP 后触发形成 Split-a@AgNCs/CAP/Split-b 夹心复合物，AgNCs 荧光增强，同时因游离 DNA 减少而使 ZNF 催化活性恢复，记录 626 nm 荧光与 652 nm 吸收实现双读出检测。

图2  双模式分裂适配体检测CAP的可行性验证。(A) 分裂CAP适配体的单点突变体设计示意，用于验证关键碱基对识别与组装的贡献。(B) 检测体系在加入 0.5 ng/mL CAP 前后荧光发射光谱对比，插图为对应的紫外灯下荧光照片。(C) 检测体系在加入 0.5 ng/mL CAP 前后吸收信号变化对比，插图为对应的自然光下溶液显色照片。

图3  双模式体系对氯霉素（CAP）的分析性能评估。(A) 荧光信号（ΔFL）与CAP浓度（0.02–150 ng/mL）的定量关系，用于建立荧光通道的校准曲线。(B) 不同CAP浓度下的荧光发射光谱，用于表征荧光通道的响应随浓度变化的趋势。(C) 吸收信号（ΔAbs）与CAP浓度（0.1–100 ng/mL）的定量关系，用于建立比色通道的校准曲线。(D) 不同CAP浓度下的比色吸收响应，用于展示比色通道的浓度依赖性输出。(E) 特异性评估：CAP为1 ng/mL，干扰抗生素为10 ng/mL，对比两通道输出以验证抗交叉反应能力。(F) 稳定性验证：以1 ng/mL CAP为模型，评估双模式读出在储存期内的信号保持度。

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c06138