金黄色葡萄球菌（SA）是一类重要的机会致病菌，广泛分布于食品、环境表面及医疗场景，并因其毒力和多重耐药性被世界卫生组织列为高优先级病原体；在乳制品、果汁等营养丰富的食品中，SA可快速增殖并带来显著食品安全风险，因此亟需一种能够在复杂基质中快速、灵敏且可定量的检测方法。传统培养法虽可靠，但通常需要24–48 h培养且定量准确性有限；核酸检测因灵敏度和特异性更高，被认为更适用于复杂食品样品的快速筛查。16S rDNA作为细菌的“分子指纹”，兼具保守性与物种特异性，是物种鉴定的经典靶标；CRISPR/Cas12a因反应更简单、更快速且无需热循环设备，并具备可编程的旁切信号放大能力，为替代qPCR提供了新路径。然而，将Cas12a直接用于食品样品仍面临两大瓶颈：其本身检测限多在pM量级，难以满足食品安全评估，同时体系易受复杂食品基质干扰。为突破这些限制，研究者提出非对称CRISPR的分段激活放大，并引入磁珠DNA walker在反应中同步完成靶标富集与净化，从而在提升灵敏度的同时增强复杂基质适用性，为食品安全现场快检提供支撑。

该研究的技术方案设计可概括为：（1）在磁珠表面构建MB-L/R2识别模块，以金黄色葡萄球菌16S rDNA（R1）为触发因子，通过链置换反应释放触发链R2；（2）将Walker链W锚定于磁珠并捕获R2，在APE1作用下识别并切割含AP位点的双链结构，启动DNA walker催化循环，连续产生并释放大量放大产物R3，同时借助磁分离实现对复杂食品基质干扰的去除；（3）引入非对称CRISPR/Cas12a级联放大机制，R3先激活全长crRNA-Cas12a触发第一轮trans-cleavage并促使全长crRNA脱离，随后由拆分crRNA接管Cas12a并在R4存在下触发第二轮激活，实现层级信号增强；（4）最终利用Cas12a对ssDNA报告分子R5的旁切效应完成双模式读出，将切割事件分别转化为荧光信号（FAM/BHQ1探针）或电化学信号（Au电极HRP-ssDNA探针在H₂O₂/HQ体系中的响应），实现对目标核酸的定量检测（图2）。

研究首先展示了该平台在荧光与电化学两种读出下均实现对SA-16S rDNA（图3）和SA整菌（图4）的可靠定量的能力。如图3所示：荧光信号随靶标浓度升高呈规律增强，并在750 zM–7.5 pM范围内具有良好线性（R²=0.9933），检测限达到7.5 aM；电化学DPV响应同样随浓度变化呈可拟合线性关系，在75 fM–750 pM范围内线性良好（R²=0.9917），检测限为1.0 fM。此外，错配序列仅产生显著降低的响应，非匹配序列接近背景，表明体系具备严格的序列选择性与低非特异背景，验证了“磁珠净化 + walker放大 + 非对称CRISPR级联”的综合增益可稳定转化为双模式高灵敏检测性能。如图4所示，荧光信号随菌量升高呈规律增强，线性范围为1.9×10³–1.9×10⁸ CFU/mL，检测限达到4 CFU/mL；电化学DPV响应同样随菌量变化可定量拟合，线性范围为1.9×10⁵–1.9×10⁹ CFU/mL，检测限为34 CFU/mL，且对E. coli、P. aeruginosa、S. enterica等非靶菌的响应显著低于SA，体现了良好的选择性。进一步在更贴近应用的条件下验证了方法的抗干扰与基质适用性：在加入干扰菌S. albus或S. epidermidis以及在牛奶、果汁等复杂食品基质中加标SA（1.9×10⁶、1.9×10⁷、1.9×10⁸ CFU/mL）时（图5），体系仍能给出可区分的荧光响应，说明磁珠净化与级联放大策略有助于在真实样品背景下保持检测可靠性

综上，本研究提出了一种接力式核酸检测策略，将磁珠锚定的APE1-DNA walker用于靶标富集与基质净化，并通过非对称CRISPR/Cas12a的分步级联激活实现二次信号放大，从而在复杂食品样品中兼顾高灵敏度与高选择性，同时支持荧光与电化学双模式输出，体现出良好的方法学通用性与场景适配能力。需要指出的是，该体系由多模块组成，涉及磁分离、酶促切割与多段CRISPR反应等步骤，整体操作链条相对较长且对关键酶与核酸组分的稳定性、批间一致性和抗污染管理提出更高要求；此外，当前验证主要集中于加标样品与有限菌种干扰，距离真实复杂样本的广泛覆盖和标准方法对照仍有提升空间。未来工作可面向“一体化与现场化”进一步推进，例如将磁分离与级联反应封装到微流控或一次性卡匣中以减少手动步骤，开发常温保存与一锅化反应以提高易用性与可重复性，并拓展多重靶标联检与更多真实食品样本的系统验证，最终形成可规模化应用的快速检测解决方案。

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图2  接力式（Relay）CRISPR/Cas12a 检测体系原理示意图，基于磁珠锚定 APE1-DNA walker 与非对称 CRISPR 级联，实现对金黄色葡萄球菌 16S rDNA 的荧光/电化学双模式检测。

图3  接力式CRISPR/Cas12a体系用于SA-16S rDNA的荧光与电化学检测性能评估。(A) 荧光读出对不同浓度SA-16S rDNA的三维响应图，浓度为0、750 zM、7.5 aM、75 aM、750 aM、7.5 fM、75 fM、750 fM、7.5 pM。(B) 荧光体系在750 zM–7.5 pM范围内的线性相关关系。(C) 荧光体系对 SA-16S rDNA序列的特异性验证。(D) 电化学体系对不同浓度SA-16S rDNA的三维信号响应图，浓度为0、75 fM、750 fM、7.5 pM、75 pM、750 pM。(E) 电化学体系对 SA-16S rDNA的线性拟合，拟合范围为75 fM–750 pM。(F) 电化学传感器对SA-16S rDNA序列的特异性验证。

图4  接力式CRISPR/Cas12a平台对整菌SA的荧光与电化学检测性能评估。(A) 荧光模式下，不同SA浓度（1.9×10³–1.9×10⁹ CFU/mL）的三维荧光响应图。(B) 荧光模式的定量线性拟合，线性范围为1.9×10³–1.9×10⁸ CFU/mL。(C) 荧光模式的特异性验证（SA与非靶菌对比）。(D) 电化学模式（DPV）下，不同SA浓度（0与1.9×10⁵–1.9×10⁹ CFU/mL）的三维响应图。(E) 电化学模式的定量线性拟合，线性范围为1.9×10⁵–1.9×10⁹ CFU/mL。(F) 电化学模式的特异性验证（SA与非靶菌对比）。

图5  实际样品中SA检测性能验证。(A) 比较该检测体系在SA、干扰菌（S. albus与S. epidermidis）以及复杂食品基质（牛奶、果汁）条件下的荧光响应强度，用于评估抗干扰能力。(B) 通过在不同体系中对SA进行加标，验证方法在干扰菌与真实食品基质中的适用性与可靠性：(a–c) 仅加SA（1.9×10^6、1.9×10^7、1.9×10^8 CFU/mL）；(d–f) 加入S. albus后再加同浓度SA；(g–i) 加入S. epidermidis后再加同浓度SA；(j–l) 牛奶中加标同浓度SA；(m–o) 果汁中加标同浓度SA。 

原文链接：https://doi.org/10.1021/acs.analchem.5c06345