铜绿假单胞菌是医院获得性感染的重要病原，耐药机制复杂，碳青霉烯耐药株（CRPA）治疗选择日益受限。CRPA的耐药性可由孔蛋白缺失、外排泵或AmpC过表达以及获得碳青霉烯酶等多因素共同驱动，其中获得碳青霉烯酶较为常见，全球以KPC-2与VIM-2等型别流行；在中国，携带blaKPC-2的产碳青霉烯酶铜绿假单胞菌检出比例较高，提示其具备持续的临床风险基础。头孢他啶-阿维巴坦（CZA）作为重要治疗选择被广泛应用，但截至2021年CRPA对CZA的全球敏感率约为38.2%，且随着使用增加，CZA耐药逐渐出现。既往研究表明，CZA耐药可与金属β-内酰胺酶、AmpC结构改变、外排泵上调以及blaKPC变体有关，其中blaKPC突变是KPC产生菌获得CZA耐药的关键环节。KPC-33是较常见的KPC变体之一，相比KPC-2，其Ω-loop的D179Y突变可削弱阿维巴坦抑制并增强对头孢他啶的水解，从而导致CZA耐药。然而，KPC变体在铜绿假单胞菌中相对少见，KPC-33在真实治疗过程中如何出现、如何引发表型转变以及是否具备传播扩散风险仍缺乏系统证据。因此，本研究聚焦临床用药压力下blaKPC-33的出现与CZA耐药转变，结合遗传学特征与全球分布分析阐明其演化与传播风险，为CZA治疗过程中的耐药预警与监测提供依据。

本研究旨在回答三个相互衔接的关键问题：

（1）在真实临床用药过程中，blaKPC-33是否会在CZA选择压力下出现，并推动铜绿假单胞菌由CZA敏感转变为耐药。

为直观呈现“用药压力与耐药转变”的时间对应关系，图1以住院时间轴整合抗菌药物暴露与连续分离菌株的关键节点，强调同一患者在连续分离过程中出现了“基因型与表型的动态演替”：早期分离株携带blaKPC-2且对CZA仍敏感，随后在CZA治疗阶段出现携带blaKPC-33的分离株并表现为CZA高水平耐药，从时间维度提示临床用药压力与KPC变体出现具有对应关系。

图1  铜绿假单胞菌分离史与临床抗菌治疗过程

（2）KPC-33的产生，其所依附的遗传载体是否具备跨菌株扩散的结构基础，从而带来传播风险并影响后续治疗与监测策略。

为揭示blaKPC-33产生与扩散的遗传学基础，图2对携带blaKPC-33的质粒进行序列比对与结构解析，明确其可位于不同质粒骨架之上并呈现与既往质粒的同源关系，从而为“耐药决定子可移动并可能传播”的风险评估提供证据支撑。进一步，图3从“耐药基因所在的可移动遗传模块”层面补全了传播机制证据。图3对多条质粒中blaKPC-33上下游遗传环境进行线性对齐比较，显示blaKPC-33并非孤立存在，而是嵌入于Tn4401-like转座子背景中，并共享一致的核心平台Tn6296（ΔISKpn27–blaKPC-33–ΔISKpn6–korC–klcA），提示其具备可作为整体被动员的“模块化”结构基础。同时，不同质粒间在该核心平台两侧存在由IS26（type I）或IS6100及相关重排（type II）介导的截短、拼接与结构变异，反映该区域具有较高可塑性和重组活性，有利于耐药模块在不同载体间的捕获与重排扩散。此外，接合转移实验从功能层面验证了该结构推断，即blaKPC-33位于可转移质粒上，其转移可使受体菌对多种β-内酰胺类药物的耐药水平升高，其中包括CZA。

图2  携带blaKPC-33的质粒全基因组环形比对分析（两类质粒骨架）

图3  blaKPC-33周围遗传环境的结构比较（转座子/插入序列介导的可移动模块）

（3）KPC-33是否已从个案演化走向群体传播，并在全球范围呈现怎样的系统发育定位与时空分布特征？

首先，图4从系统发育层面评估KPC变体相关菌株是否已出现群体传播线索。在图4A中，作者对9株blaKPC-33阳性铜绿假单胞菌进行核心基因组SNP比较并构建系统发育树，结果显示这些菌株可分为多个谱系，且部分菌株之间SNP差异较小，并提示KPC-33产生CRPA可能在特定区域发生“医院到医院”的传播。图4B显示，在714株KPC产生CRPA中共检出52个ST，ST463占45.66%（326/714）为最主要高危克隆，其次为ST235占9.80%（70/714）；且ST463型KPC产生CRPA仅在中国检出，并携带blaKPC-2或其衍生变体，提示优势克隆背景可能促进KPC变体的产生与扩散。结合图5，KPC产生CRPA呈显著区域性聚集：亚洲占64.1%（458/714），北美占17.51%，南美占16.11%，欧洲仅2.00%；国家层面以中国最多（63.02%，452/714），其次为美国（17.29%）和哥伦比亚（7.53%）。同时型别构成以KPC-2为主（93.28%，666/714），且在CZA获批后（2015年）开始报告与CZA耐药相关的KPC变体（含KPC-33），从群体与时空维度强化了对KPC变体监测与预警必要性的论证。

图4  blaKPC-33阳性铜绿假单胞菌与全球KPC产生CRPA的系统发育分析

图5  全球KPC产生碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（KPC-producing CRPA）的地理与时间分布

综上，本研究以真实临床治疗过程为线索，将“CZA治疗后出现耐药”的临床现象与分子机制贯通，提示blaKPC-2可在药物选择压力下通过关键位点突变演化为blaKPC-33并导致CZA失效，同时耐药决定子可随质粒在菌株间转移，且其位于两类不同质粒骨架与可移动遗传结构之中，进一步结合系统发育与全球数据刻画其潜在传播背景，从而把“体内演化”“可移动载体”“传播风险”串成一条相对完整的证据链，体现了从个案到群体视角的创新整合。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s44259-024-00073-0