抗菌药物耐药性加剧使临床迫切需要更快获得病原体及其药物敏感表型，以便尽早从经验性广谱用药转向精准治疗。现行金标准表型药敏通常必须先对标本进行培养扩增并分离纯菌落，再做梯度抑菌实验并判读MIC，往往需要数天，延误决策并增加不合理用药风险。基因检测虽快，但难以覆盖全部耐药机制，也不能直接给出MIC及真实表型。已有部分快速表型技术仍面临流程复杂、自动化不足、可扩展性差且药物条件有限等问题。因此，本研究提出将纳米等离激元结构色与微流控并行筛查和自动化操作集成，利用细菌代谢引发的早期氧化还原变化产生可量化颜色位移，实现从原始标本出发的分钟级MIC判定并同步完成病原识别，为床旁去中心化快速AST提供新的可行路径。

一、设计原理

QolorPhAST的设计原理基于对传统抗生素敏感性检测（AST）流程的根本性重构。传统AST需要经历尿液样本采集、过夜培养（>18小时）、菌落纯化、再次培养（>18小时）和最终药敏测试的漫长流程，整体周转时间通常至少36小时，严重延误精准治疗时机。QolorPhAST通过纳米等离子体结构色技术彻底绕过培养扩增步骤，将标本引入到结果输出的时间压缩至36分钟。系统的核心创新在于仿生蜻蜓眼设计的周期性半球纳米图案（Pphen）。当活菌代谢活跃时，NAD+还原为NADH释放电子，介导resazurin染料早期部分还原（约20%进度），引起周围介质折射率微小变化。Pphen纳米结构将这一微变转化为显著的可见光颜色偏移，实现"部分化学反应=完整视觉信号"的加速效应，可在约30分钟内达到传统比色法约4小时才出现的肉眼可见色变趋势。系统采用双模块并行架构：IDtyping模块利用纳米等离子体增强LAMP技术，15分钟完成10种常见尿路病原菌的核酸鉴定；AST模块通过代谢活性检测，30分钟测定2种抗生素的11浓度梯度MIC值。两个模块共享同一Pphen光学平台和PhenoBot自动化系统，实现"样本进-结果出"的全流程自动化。微流控芯片集成可调吸力流体驱动、纸滤膜细菌富集和24个并行流体单元，确保操作标准化和结果可重复性（图1）。

图1  QolorPhAST系统设计。a 传统与QolorPhAST检测流程对比。b QolorPhAST系统构成。c 比色信号机制。d 纳米限域等离子体检测原理。e LAMP快速鉴定流程。f 直接尿液AST检测原理。

二、病原鉴定与AST分析性能展示

在病原鉴定方面（图2）：QolorPhAST的IDtyping模块基于纳米等离子体增强LAMP技术，针对10种覆盖>99%非复杂UTI常见尿路病原体谱的病原菌设计特异性引物组。系统检测范围跨越50-10⁶ cps/ml，完全覆盖临床UTI的细菌载量范围。特异性验证采用34株临床分离株，10组引物对各菌种的识别准确率100%，无交叉反应。MALDI-TOF质谱和qPCR平行验证确认鉴定可靠性。整个流程在芯片上完成细菌裂解（5 min）和等温扩增（10 min），总耗时15分钟，较传统培养鉴定（18-24 h）实现两个数量级的加速。

图2  QolorPhAST病原鉴定（IDtyping）性能。a 微流控芯片LAMP鉴定原理示意图。展示芯片上65°C细菌裂解及DNA等温扩增流程，LAMP引物通过形成哑铃状结构实现指数级核酸扩增。b 10种尿路病原菌多重筛查设计。微流控芯片并行配置10组物种特异性LAMP引物，覆盖大肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌等主要致病菌。c 靶基因位点。大肠杆菌malB基因（3,204-3,407 bp）及肠球菌rpoB基因（2,760,142-2,763,756 bp）的引物靶向区域示意图。d 大肠杆菌鉴定灵敏度与特异性。左：检测限50拷贝/ml，线性范围50-10⁶拷贝/ml；中：信号与DNA浓度对数线性相关；右：对非靶标菌无交叉反应（P<0.001）。e 肠球菌鉴定灵敏度与特异性。检测性能与大肠杆菌相当，验证引物设计的普适性。f-g MALDI-TOF质谱验证。质谱峰图及PCR凝胶电泳确认LAMP扩增的物种特异性。h qPCR定量验证。标准曲线显示QolorPhAST与qPCR定量结果高度一致。i 34株临床菌株鉴定特异性热图。10组引物对34株革兰氏阴性及阳性菌的检测矩阵，绿色示阳性，蓝色示阴性，对角线特异性100%。

在AST分析方面（图3）：QolorPhAST的AST模块通过微流控芯片实现全流程自动化操作。芯片预装培养基、resazurin染料及抗生素浓度梯度，尿液样本经毛细作用加载后，可调吸力机制驱动流体混合、细菌过滤富集（回收率>86%）及检测室填充，37°C孵育30分钟后完成成像分析。MIC测定准确性经系统验证：革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（粪肠球菌）的剂量-反应曲线与金标准BMD高度一致（R²=0.988和0.996）；进一步在12种细菌与15种抗生素所覆盖的88种菌药条件下验证，MA-MIC与SVM-MIC相对BMD实现100% EA与100% CA，ROC-AUC为0.97。针对多菌株验证，11株大肠杆菌和10株粪肠球菌临床分离株在环丙沙星和呋喃妥因条件下的MIC测定EA均为100%，且在3:1尿液稀释基质中性能稳定，证明对真实样本基质具有适用性。机器学习辅助判读通过支持向量机（SVM）算法自动分析RGB颜色矩阵，输出MIC值和敏感/耐药分类，消除人为判读误差，实现标准化报告。时间优势显著：从样本加载到结果输出的总周转时间为36分钟，较传统BMD（>18 h）和过夜培养联合快速AST（~16 h）分别缩短30倍和26倍。

图3  QolorPhAST药敏试验（AST）性能验证。a 微流控芯片整体结构。b 芯片操作流程与元件性能。（i）毛细管止回阀预装抗生素-培养基-染料；（ii）尿液加载、混合、过滤（细菌回收率>86%）；（iii）泵送曲线验证流体控制精度。c 微流控电路设计。d 成像分析与ML判读流程。原始图像分割为20子图，RGB三维空间特征提取，手机APP输出MIC报告。e 代表性菌种剂量-反应曲线。大肠杆菌（革兰氏阴性）和粪肠球菌（革兰氏阳性）的QolorPhAST信号与BMD荧光/吸光度高度一致（R²=0.988和0.996）。f 传统BMD对照。g-h MIC定量一致性比较。革兰氏阴性菌EA 96.67%，革兰氏阳性菌EA 100%；数据点沿1:1线分布，验证方法准确性。i-j 多菌株验证。11株大肠杆菌和10株粪肠球菌临床分离株的环丙沙星、呋喃妥因MIC测定，EA均为100%，尿液基质（3:1稀释）无显著干扰。k 系统性MIC验证热图。12种菌-15种抗生素（88组合）的MA-MIC和SVM-MIC分析，均达100% EA和100% CA，ROC-AUC 0.97。

三、临床适用性评价

QolorPhAST的临床适用性通过54例疑似尿路感染患者的前瞻性盲法研究得到验证。研究设计严格模拟真实临床场景：患者尿液样本采集后1小时内送达，同步进行标准临床工作流程（定量培养、MALDI-TOF鉴定、BMD药敏）和QolorPhAST直接检测，两者结果互盲。结果显示：

（1）病原鉴定性能优异。在36例阳性样本中，QolorPhAST IDtyping与MALDI-TOF的物种鉴定一致性达100%，大肠杆菌检出率61.9%（26/36），与流行病学数据相符。QolorPhAST表型生长检测与标准培养定量结果高度相关（P<0.001），生长判定准确率99%。

（2）药敏试验核心指标满足临床标准。QolorPhAST直接尿液检测与BMD的基本一致性（EA）为86.4%，分类一致性（CA）为91.81%，无非常重大错误（假敏感）。ROC曲线分析确认平均准确度。7例患者配对验证显示，直接尿液与培养分离菌的MIC结果100%一致，证明直接样本检测的可靠性。

（3）时间优势具有临床决策价值。QolorPhAST总周转时间36分钟，较传统BMD（>18小时）和过夜培养联合快速AST（~16小时）显著缩短，为急诊科、ICU等场景的精准抗生素早期治疗提供技术支撑。

图4  盲法前瞻性临床概念验证研究：在临床疑似尿路感染患者中，直接对尿液标本使用QolorPhAST进行表型药敏检测。a：对比标准临床AST流程与QolorPhAST流程；并展示两种路径的MIC判定：1）直接由患者尿液得到MIC；2）对培养分离得到的菌落再测MIC；技术重复数nTechnical=10。b：患者样本按感染状态、UTI是否复杂、以及菌种构成的分布；其中4例（7.4%）因污染排除；标准培养与QolorPhAST均未见细菌生长的标本为14例（25.9%）。c：病原识别一致性验证：以MALDI-TOF为参照，对比QolorPhAST的IDtyping结果，并给出主要致病菌比例（如E.coli占比最高等）。d：盲法患者样本的结果总览：用热图与汇总表展示两种判读策略得到的MIC，直接信号判读MA-MIC与机器学习判读SVM-MIC；并与金标准BMD对照，按CLSI-M100 S31断点换算为S/I/R分类。e：用于计算EA的MIC一致性比较：比较QolorPhAST与BMD的MIC；阴影区表示EA判定范围，即与BMD相差不超过1个二倍稀释梯度；仅纳入量程内（on scale）的数据点。f：CA与不一致类型统计：分别对呋喃妥因与环丙沙星，给出与BMD相比的分类一致性CA及各类不一致情况。g：ROC曲线汇总整体判别性能；给出平均EA=86.4%，平均CA=91.81%（针对环丙沙星与呋喃妥因）。h：周转时间对比（n=4独立重复）：从尿液开始，QolorPhAST在微流控器件内完成自动化等离激元比色读出为36分钟；对照传统BMD需要两次过夜培养加药敏；另一个比色方法需要一次过夜培养加快速药敏；并说明患者样本MIC以技术重复与多次读数获得，最终报告为所有技术测量的平均值。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41565-025-02075-z