1.引言

针对多重耐药革兰氏阴性菌感染，多粘菌素作为最后防线抗生素，其耐药性的全球上升引发了严重公共卫生担忧。然而，传统的药敏检测方法（如肉汤微量稀释法）耗时较长（至少24小时），且现有快速检测手段存在局限性，无法满足临床及时治疗的需求。尽管已有研究利用荧光探针进行细菌成像，但大多数探针未能保留母体抗生素的活性，难以准确反映药物的作用机制。因此，开发一种既能保留抗菌活性又能用于快速检测耐药性的新型探针，成为解决这一临床痛点的关键方向。

本研究开发了一种名为RAPID_FC的快速药敏检测技术，通过点击化学（CuAAC）方法将荧光基团NBD特异性连接到多粘菌素B的环状核心位置，合成了保留了母体抗生素抗菌活性的荧光探针PMX-NBD。在试验方法上，该研究利用流式细胞术，通过对比细菌在1μg/mL和16μg/mL两个浓度探针下的荧光强度几何平均值（GMean）差异（ΔF）来判定药敏性。解决了传统多粘菌素药敏检测方法（如肉汤微量稀释法）耗时长（需24小时以上）且操作复杂的问题，将检测时间缩短至45分钟，实现了对革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌）药敏情况的快速准确分析。

2.结果与讨论

PMX-NBD探针的合成与表征：利用点击化学将NBD荧光基团特异性连接至多粘菌素B核心骨架，通过质谱和核磁共振验证结构，证明探针保留了母体抗生素的化学特征与正电荷性质。

图 1 阿西多-PMX-P7-N的合成3 6 采用“离树脂”环化策略和环加成反应生成荧光探针 PMX-NBD 2。

探针抗菌活性验证：通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度，证实PMX-NBD对多种革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、铜绿假单胞菌）的抗菌活性与母体药物多粘菌素B相当，证明其生物活性未因标记而丧失。

图 2 对大肠杆菌ATCC 25922、肺炎K. pneumoniae ESBL ATCC 700603、P. aeruginosa（ATCC 27853）、A. baumannii ATCC 19606和金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）进行活细胞共聚焦显微镜荧光成像，均使用PMXB衍生的荧光探针PMX-NBD 2处理。细菌先用PMX-NBD在2 μg/mL下处理30分钟，随后与FM4-64FX和Hoechst 33342共染色。绿色：抗生素衍生的荧光探针;红色：FM4-64FX（细菌膜），蓝色：Hoechst 33342（核酸）。图像代表n=3个实验。比例条代表5微米。（关于该图例中关于颜色的解释，请阅读本文的网络版。）

体外快速药敏检测性能：利用流式细胞术检测细菌与探针结合后的荧光强度，通过比较1 μg/mL与16 μg/mL浓度下的ΔF值，成功在45分钟内区分敏感菌与耐药菌株，验证了RAPID_FC技术的可行性。

图 3 细菌的流式细胞术分析，使用PMX-NBD 2。利用流式细胞术对不同物种的PMX-NBD和非选择性细胞渗透染料SYTO® 60进行细菌标记。细菌在2 μg/mL（37°C，30分钟）浓度和SYTO® 60（5 μm，冰上10分钟）处理细菌，然后使用流式细胞仪测量荧光强度。

临床菌株检测应用：将该方法应用于100余株临床分离的革兰氏阴性菌，结果显示与传统肉汤微量稀释法相比，RAPID_FC具有高符合率（>95%），证明其在实际样本中检测的准确性与可靠性。

图 4 PMX-NBD 2基于流式细胞术的PMXB敏感性检测工作流程。一夜培养液在新鲜CAMHB中稀释40倍，并在37°C培养至中期，然后采集1毫升培养液，并与PMX-NBD溶液（1 mL）以两种不同浓度（1,16 μg /mL）在37°C摇晃下培养30分钟，然后用流式细胞术（Cytoflex S，Beckman Coulter，Inc.，地址：250 S. Kraemer Blvd. Brea.，CA 92821 U.S.A.）。用 BioRender.com 制作的模型。

机制与特异性验证：通过竞争性抑制实验，证实PMX-NBD的结合可被过量未标记多粘菌素B阻断，且在耐药菌中荧光信号显著降低，进一步阐明其结合靶点为细菌外膜LPS并反映耐药机制。

图 5 使用RAPID进行PMX-NBD 2的PMXB易感性测试FC方法。细菌用PMX-NBD在1 μg/mL和16 μg/mL下处理，持续30分钟并摇晃。随后用HBSS洗涤一次细胞，再将悬浮细菌稀释于HBSS中进行流式细胞术测量。（A）治疗后发现PMX-NBD基因大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。（B）大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的相对较高荧光，计算方法为（GMean16μg/mL/GMean控制） − （GMean1μg/mL/GMean控制).（C） 肺炎K. pneumoniae比例增加 = （Gean16μg/mL/GMean控制） − （GMean1μg/mL/GMean控制).（D） 金银杆菌比例增加 = （GMean16μg/mL/GMean控制） − （GMean1μg/mL/GMean控制).S：对PMXB敏感，MIC含量为≤2 μg/mL，;新星：对PMXB不敏感，MIC含量为≥4 μg/mL。实验分三次进行。统计显著性（*P ≤ 0.05，**P ≤ 0.01）通过未配对的t检验显示在易感株和非易感株之间。

3.总结

本研究的核心优势在于成功开发了兼具生物活性与荧光特性的探针PMX-NBD，并建立了名为RAPID_FC的快速药敏检测方法。该技术巧妙地避开了单一浓度荧光强度干扰大的问题，创新性地采用双浓度荧光强度变化量（ΔF）作为判别标准，显著提高了检测的准确性与可靠性。相比传统方法，该技术将检测时间从24小时大幅缩短至45分钟，极大地满足了临床对于快速诊断的需求。同时，该方法操作简便，适用于流式细胞术高通量分析，为临床快速指导多粘菌素用药提供了强有力的新工具，具有显著的临床应用价值和推广前景。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.jare.2026.01.019