重组腺相关病毒（rAAV）因其良好的安全性和稳定的转基因表达能力，已成为体内基因治疗最常用的病毒载体之一。目前全球已有超过350项基于rAAV的临床试验，7款药物获批上市。然而，rAAV的大规模生产仍是制约其广泛应用的主要瓶颈。传统的瞬时转染平台虽然适用于小规模制备，但在商业化生产中面临成本高、可扩展性差等问题。

建立稳定生产细胞系（PCL）被视为更有前景的替代方案。PCL具有可全面表征、批次间一致性高、成本可控等优点。然而，已有的PCL构建方法大多依赖含血清的培养基，血清不仅存在批次差异，还可能引入外源污染因子，不符合现代基因治疗产品的监管要求。

针对这一痛点，来自葡萄牙实验生物学与技术研究所（IBET）和赛诺菲（Sanofi）研发团队的研究人员，系统优化了PCL构建的各个环节，首次实现了全流程无血清条件下的rAAV高产细胞株开发。

研究首先比较了多种转染方法在无血清条件下的表现。结果显示，常规脂质体转染和电穿孔在无血清环境中效率极低，而核转染（Nucleofection）能够在保持90%细胞活性的同时，实现近40%的初始转染效率。通过设计实验（DoE）进一步优化参数，转染效率被提升至70%以上，且细胞活性保持在85%以上。

值得关注的是，研究团队发现质粒的拓扑结构对后续细胞株产毒能力有显著影响。虽然线性化质粒的转染效率低于环状质粒（11%对39%），但通过“Masterwell”筛选方法，环状质粒转染所获得的细胞池中，高产孔的比例远高于线性质粒组。环状质粒来源的细胞池中，有39%的样品rAAV产量超过10⁸ vg/mL，而线性质粒组这一比例仅为6%。进一步分析表明，环状质粒的整合拷贝数与产量呈正相关，且同样能够实现AAVS1位点的特异性整合。

图1 线性质粒与环状质粒构型表征

单细胞克隆是建立均一、合规细胞系的关键步骤。在无血清条件下，单细胞存活和扩增极为困难。研究人员通过添加条件培养基（CM）和商业补料Supplement II，并借助DoE优化配方，最终确定的培养基组合（50% DMEM/F12、25% EX-CELL、20% CM、5% Supplement II）可使单细胞克隆效率达到60%以上，与传统含血清培养基相当。

利用上述优化流程，研究团队成功筛选出rAAV5和rAAV2血清型的高产克隆，产量超过10¹⁰ vg/mL，部分克隆的满/空衣壳比例达到70%左右。对于携带专利转基因和衣壳组合的细胞株，无血清流程所获得的细胞池产量与传统血清工艺相当，且所产病毒的生物学活性一致。

综上所述，该研究建立的无血清PCL构建流程，不仅解决了传统方法对血清的依赖问题，还显著缩短了细胞株开发周期，为rAAV基因治疗药物的规模化、低成本生产奠定了坚实基础。

在细胞培养和生物制药过程中，培养基的质量直接决定工艺的稳定性与产品的合规性。针对疫苗及基因治疗载体生产对无血清、化学成分限定培养基的需求，环凯公司提供一系列高性能疫苗培养基产品，支持Vero、CHO、HEK293等多种细胞的高密度无血清悬浮培养，助力企业构建符合监管要求的现代化生产工艺。 环凯培养基采用严格的质量控制体系，批次一致性高，可有效降低外源污染风险，为从研发到商业化生产提供可靠支撑。

参考来源：Escandell JM, Dias M, Gonçalves M, Pais D, Conceição A, Mathur A, Balva B, Sen S, Figueroa B, Vincent KA, Gomes-Alves P. Development of a serum-free producer cell line generation process for scalable and efficient rAAV production for gene therapy applications. J Biotechnol. 2026 May;413:1-11. doi: 10.1016/j.jbiotec.2026.02.006. Epub 2026 Feb 14. PMID: 41698607.