感染的早期诊断决定用药时机，但败血症、肺炎等危重感染在血流或肺部渗出液中的细菌负荷可低至1至100 CFU每毫升，抗菌治疗每延迟1小时生存率下降7.6%，现有技术难在如此低水平下稳定检出，培养又耗时数天，易致经验用药。虽然宏基因组学可用于非培养样本，但通常需要更高病原量且适用样本受限。单细胞拉曼光谱能无标记获得病原体生化指纹并用于属种乃至株水平识别，但既往研究多基于分离株或加标样本，且依赖多轮离心清洗等人工前处理，即便MicroBio-Raman推动开放数据库，仍缺少从患者样本到临床决策的整合工作流。因此，本研究提出20分钟无培养“样本到结果”方案，结合微流控富集、迄今最大的拉曼指纹数据库与深度学习，实现快速广谱感染诊断。

一、工作原理

该研究构建了一套“样本进入到结果输出”的无培养快速诊断流程。图1显示，与传统方法需要先采集样本、接种培养基、孵育24至48小时，慢生长细菌或真菌甚至需要数天后再通过MALDI-TOF进行鉴定不同，本文方法直接从临床样本出发，将尿液、血液、胆汁等样本导入AutoEnricher微流控富集系统，在15分钟内完成病原体的快速分离与富集，再进行单细胞拉曼光谱检测（<5分钟），从而跳过传统培养这一耗时步骤。

其核心机制是将前端富集、中端表征和后端智能识别整合为一个闭环。首先，AutoEnricher采用透析-介电泳（Dialysis-DEP）技术，通过膜透析将样本导电率从生理水平降至<10 mS/m，再利用正介电泳力在叉指电极阵列上选择性捕获病原体，同时排弃血细胞等干扰成分；随后，对富集到的单细胞进行拉曼光谱采集，获取病原体的生化"指纹"信息；最后，将这些光谱输入由342株临床分离株（涵盖29种细菌和7种真菌）训练得到的1D ResNet模型，实现病原体的快速分类识别。整个流程依托总计102,600条单细胞拉曼光谱的数据库作为识别基础，因此能够把单细胞表型信号转化为可自动判读的病原学结果。

整体来看，这一方法的本质并不是单纯提升某一个检测步骤的效率，而是建立了一条替代传统培养流程的快速诊断路径，即通过“微流控直接富集病原体+单细胞拉曼获取表型特征+深度学习完成分类判读”的方式，把原本以小时到天计的培养鉴定压缩到20分钟内完成。经305例患者前瞻性验证，证明方法的实际应用价值。

图1  传统培养鉴定与无培养“样本到结果”病原识别流程对比。

二、方法性能

在前端富集环节，图2表明系统对极低病原负荷仍具备稳定捕获能力。对2至231 CFU/ml的低浓度样本，捕获细胞数与理论输入数呈线性相关，平均斜率0.84±0.06且R²大于0.98，外推至全芯片捕获效率超过84%，最低可支持约2 CFU/ml水平的病原捕获；同时，系统可将捕获细胞释放并输送至芯片开口窗口，约150 CFU/ml条件下释放率为95.6±1.1%，并形成小于3 μl的浓缩液滴，为后续显微判读与拉曼检测提供可操作样本。

在后端识别环节，图3显示基于临床分离株数据库训练的1DResNet在36种病原物种层面总体平均准确率为95.1%，其中27种达到100%；按革兰阴性、革兰阳性与真菌三大类汇总后准确率分别为99%、100%与100%。同时，临床应用所需光谱数较少，5条光谱可达96.6%，10条可达98.4%，测10至15个细胞的拉曼时间约4至5分钟，有利于纳入20分钟工作流。        在临床分流性能方面，研究建立了（图4），细菌为300/mm2、真菌为200/mm2，且对脑脊液、血液、胆汁和引流液等通常无菌样本，只要可见病原即判为阳性；在305例临床样本中实现20分钟内sample-to-report，总体准确率95.4%，灵敏度98.5%，特异度83.6%，共291例判定正确。

在临床病原鉴定性能方面，图5对120份培养阳性、经MALDI-TOF鉴定且所检病原体已纳入拉曼数据库覆盖范围的样本进行单细胞拉曼验证，并基于40例尿路感染样本对模型微调，拉曼鉴定与培养加MALDI-TOF总体一致率为82.5%；分组结果显示单一感染80.4%、混合感染91.3%，含细菌样本78.6%，含真菌样本100%。物种层面性能存在差异，肺炎克雷伯菌（7/21，33.3%）和奇异变形杆菌（1/5，20%）表现较差，提示后续需进一步扩充细菌菌株多样性并针对低表现物种优化数据库与模型。

图2  低浓度条件下细菌的高效富集与释放。

图3  ResNet模型对342株临床分离株的分类性能混淆矩阵。

图4  基于富集系统与拉曼显微镜的临床病原体快速鉴定。

图5  120例患者样本的单细胞病原识别临床评估。

总体而言，该研究的创新在于将透析-DEP微流控富集、单细胞拉曼和1D ResNet整合为一条20分钟内完成的无培养诊断链路，并以迄今最大规模的临床分离株数据库和305例真实样本验证其临床转化潜力，推动病原检测由“培养后鉴定”转向“样本直达结果”。但其证据仍有局限，如仅对254份阳性样本中的120份进行了拉曼验证，且样本以尿液为主；同时，细菌识别仍弱于真菌，培养作为参照标准也可能引入偏倚。未来应扩充细菌尤其耐药变异株数据库，提升模型可解释性与不确定性评估，并开展更大规模多中心验证，进一步与药敏检测和临床流程衔接。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-66996-y