1. 引言

致病菌快速检测及总菌与活菌同步区分对食品安全和临床感染防控至关重要。传统培养法耗时冗长，核酸检测虽灵敏却难以区分死活菌，PMA 辅助方法易受基质干扰且步骤繁琐。细菌死亡后 DNA 保持稳定，而 RNA 快速降解，为死活菌鉴别提供了天然依据。

CRISPR/Cas 系统具有高特异性识别核酸的优势，其中 Cas12a 可响应 DNA、Cas13a 可响应 RNA，且二者互不干扰。据此，本研究构建双 CRISPR/Cas 驱动无扩增 SERS 生物传感器，结合智能手机便携式拉曼实现现场检测，无需核酸扩增即可同步定量总菌与活菌，为快速、精准、高灵敏的致病菌筛查提供新策略。

2. 结果与讨论

原理：Cas12a 被靶 DNA 激活→切割报告基团产生520 nm 荧光（总菌）；Cas13a 被靶 RNA 激活→产生570 nm 荧光（活菌）。

结果：

仅 DNA 存在→仅 520 nm 信号（死菌）。

DNA+RNA 共存→双信号（活菌）。

空白对照组无明显信号。

验证双通路互不干扰、独立响应，可区分死菌 / 活菌见图1。

线性范围：10³–10⁷ CFU/mL，R²>0.96。

特异性良好，仅目标菌（金黄色葡萄球菌）有响应。

检测限约10³ CFU/mL，灵敏度不足，需进一步增强见图2。

材料表征：Au@Ag 核壳纳米粒子紫外吸收与粒径证明成功合成。

SERS 信号规则：

空白：MB 磁珠捕获全部 SERS 标签→上清无信号。

死菌：Cas12a 切割 DNA→仅1079 cm⁻¹ 信号。

活菌：Cas12+Cas13 双切割→1079 + 593 cm⁻¹ 双信号。

两组 SERS 信号无串扰、响应稳定见图3。

灵敏度：线性 10¹–10⁷ CFU/mL，检测限≈10 CFU/mL。

特异性：非目标菌无明显信号，识别精准。

稳定性 / 重复性：RSD 值低，测量可靠。

实际样品：奶粉、牛奶中加标回收率良好，基质干扰小见图4。

更换 crRNA 即可实现第二种致病菌检测。

性能一致：线性良好、LOD≈10 CFU/mL、特异性强、实际样品适用。

证明平台可程序化、通用化见图5。

创新设计首次将Cas12a（DNA）+ Cas13a（RNA） 双通路联用，利用 “死菌 DNA 稳定、RNA 降解” 实现一管同步测总菌 + 活菌。

性能优势

无核酸扩增，避免假阳性与污染。

SERS 增强 + 磁分离，灵敏度达10 CFU/mL。

全程45 分钟，配合智能手机可现场检测。

机制合理性

4‑ATP（1079 cm⁻¹）与 NBA（593 cm⁻¹）拉曼峰无重叠，信号互不干扰。

双 CRISPR 系统在同一体系中独立工作、无交叉抑制。

应用价值可直接用于食品、临床、环境样本，实现 “快速筛污染（总数）+ 判风险（活菌）”，比传统方法更高效、更具临床指导意义。

3.总体结论

本研究开发了双 CRISPR/Cas 驱动无扩增 SERS 生物传感器（cc‑SERS），实现单管同步检测目标细菌总数与活菌数。

以 DNA 指示总菌、RNA 指示活菌，无需核酸扩增，避免非特异性扩增。

检测限低至10 CFU/mL，线性范围宽、特异性强、稳定性好。

结合快速前处理与智能手机拉曼，45 分钟内完成现场检测。

成功应用于金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌，具备良好通用性与扩展性。

该方法为食品安全与临床感染的快速、精准、现场筛查提供了全新技术方案。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2026.118446