瓣状核酸内切酶1是DNA代谢过程中的关键酶，主要负责在DNA复制中切割冈崎片段前体的5‘-瓣状结构，并参与DNA损伤修复、端粒稳定维持及细胞凋亡等多种生理过程。FEN1功能失调会损害基因组稳定性，导致多种染色体畸变。研究发现，FEN1在多种恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌、脑胶质瘤、胃肠道癌症）中存在过表达现象，这使其成为一种有潜力的癌症诊断生物标志物和抗癌药物（特别是那些靶向DNA修复途径的药物）的治疗靶点。因此，开发能够准确、灵敏地检测FEN1活性的方法，对于癌症的早期诊断、发病机制研究和抗癌药物筛选具有重要意义。

传统的蛋白质定量方法（如Westernblot、ELISA）虽可检测FEN1总蛋白量，但无法区分其是否有活性，更无法用于酶抑制剂的筛选。近年来，利用FEN1切割特异性DNA底物（如5‘-瓣状结构）产生的序列特征，研究人员开发了一系列结合信号放大技术和纳米技术的生物传感器。其中，基于荧光信号（如荧光探针、荧光染料、CRISPR/Cas系统）的检测方法虽灵敏特异，但依赖昂贵的荧光检测设备，限制了其广泛应用和即时检测潜力。

脲酶能够高效催化尿素水解产生氨和二氧化碳，导致溶液pH值升高，从而引起石蕊染料（如酚红）发生明显的颜色变化（从黄色到粉红色）。这一过程可将核酸信号转化为直观的比色信号，具有可视化、设备依赖性低的优点。本研究巧妙地将核酸滚环扩增的高效信号放大能力、磁珠的靶标富集能力与脲酶催化的可视化优势相结合，旨在构建一个灵敏、便捷、可视化的FEN1活性检测平台，以满足癌症研究和药物开发中的实际需求。

研究内容

图1.拟议FEN1活性测定方法的设计原理

第一步是靶标识别：设计了一个带有5‘-瓣状结构的哑铃形探针。当FEN1存在时，特异性切割此瓣状结构，产生一个可连接切口。T4DNA连接酶将该切口连接，形成一个封闭的环形DNA模板。第二步是信号放大：环形模板在Phi29DNA聚合酶和生物素化引物作用下启动滚环扩增，产生含有大量重复序列的长单链DNA。预先设计的、与重复序列互补的脲酶标记DNA与RCA产物杂交。通过生物素-链霉亲和素相互作用，该杂交复合物被链霉亲和素磁珠捕获。第三步是信号读出与可视化：固定在磁珠上的脲酶水解尿素产生氨，使溶液pH升高，导致酚红指示剂从黄色变为粉红色。颜色变化既可用光谱法测量吸光度比值量化，也可用智能手机拍照并通过分析RGB值进行定量，从而实现FEN1活性的可视化、高灵敏检测。

图2.BP和Ur-DNA的设计

初始设计虽可产生强阳性信号，但也导致了较高的背景信号，这是因为BP和Ur-DNA之间可能发生非特异性杂交，导致无靶标时Ur-DNA也被磁珠捕获。调整设计以减少互补性虽然降低了背景，但也意外降低了阳性信号，推测是因为Ur-DNA与RCA产物的双链区域互补，存在结构竞争，影响了识别效率。最终优化的设计确保了Ur-DNA与RCA产物单链区高效结合，同时与BP之间仅有三个碱基互补，从而在实现高检测效率的同时，能清晰区分阴阳性样本。实验也证实，过短的引物会因结合效率低而降低RCA效率和最终信号。

图3.可行性验证

凝胶电泳结果清晰展示了从原始FDP探针，到被FEN1切割，再到连接成环，最终产生高分子量RCA产物的逐步过程。阴性对照（缺少FEN1或T4连接酶）则无法产生RCA产物。比色对照实验表明，只有在包含所有必需组分（FEN1,FDP,T4连接酶,Phi29聚合酶,BP）的反应体系中，溶液才会呈现明显的粉红色并具有高A570/A443比值。缺少任何关键组分，颜色均保持黄色，信号与阴性对照相当。

图4.传感策略的分析性能

光谱分析显示，A570/A443比值与FEN1浓度的对数在10-5到0.1U/μL范围内呈良好线性，检测限为5.3×10-6U/μL。肉眼观察可见，FEN1浓度高于10-4U/μL时，溶液颜色从黄色渐变为粉红色。利用智能手机拍照并提取图像的(G+B)/R值进行量化，在2×10-6到0.02U/μL范围内呈现优异线性，检测限低至1.5×10-6U/μL，其定量范围和灵敏度优于光谱法。该方法的选择性极佳，其他核酸酶（如HindIII,ExoIII等）和蛋白质（如人血清白蛋白）均不产生明显干扰信号。实际应用验证表明，肺癌细胞A549的核蛋白提取物中FEN1活性显著高于正常支气管上皮细胞BEAS-2B，且FEN1主要定位于细胞核，与已知生物学特性一致。在含1%人血清的基质中进行加标回收实验，回收率良好，证明了其抗基质干扰能力。

本研究成功构建了一个集核酸扩增、磁富集与酶催化于一体的智能手机辅助比色生物传感平台，用于FEN1活性及其抑制剂的超灵敏、可视化检测。该平台通过FEN1特异性切割触发“切割-连接-RCA”级联反应，将酶活性信号转化为核酸信号并大幅放大；利用脲酶标记DNA探针识别RCA产物，并通过磁珠富集与脲酶催化，将核酸信号进一步转化为明显的pH变化和颜色变化。该方法检测限低（智能手机法达1.5×10-6U/μL），选择性高，并能有效避免磁珠的背景干扰。其成功应用于区分癌细胞与正常细胞中FEN1的活性差异，并实现了对模型抑制剂ATA的效价评估，证明了其在癌症生物学研究和抗癌药物发现中的实用价值。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117969