无血清配方革新：猪胚胎干细胞培养迎来"去血清化"技术突破

原创

来源：李湘

2026-02-27 10:32:00

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核心提示：本研究开发了仅含FGF2、IWR-1和WH-4-023三种因子的简化无血清培养基，成功建立了可单细胞传代、长期稳定培养且适配无饲养层条件的猪胚胎干细胞系，为农业基因编辑和生物医学研究提供了高效便捷的技术平台。

本研究成功开发了一种简化的无血清培养基（FIW培养基），仅包含三种关键因子：FGF2、IWR-1和WH-4-023，即可有效建立和维持猪胚胎干细胞（pESC-FIW）。通过系统的培养条件优化实验，研究人员发现DMEM/F12作为基础培养基效果最佳，而α-MEM由于缺少某些无机盐成分无法支持细胞集落形成。在添加CHIR99021（CHIR）的FIC条件下，细胞表现出向神经命运分化的倾向，因此最终确定FI组合为基础，并通过添加SRC抑制剂WH-4-023进一步优化，显著提升了细胞的单细胞克隆效率和增殖能力。

建立的pESC-FIW细胞系展现出典型的多能干细胞特征。免疫荧光染色显示，这些细胞均匀表达核心多能性转录因子POU5F1、NANOG和SOX2，以及细胞表面标志物SSEA-1、SSEA-4和TRA-1-60，但不表达TRA-1-81。细胞呈现圆顶状集落形态，碱性磷酸酶活性强。在长期培养稳定性方面，pESC-FIW表现优异，即使经过50代以上的传代，仍能保持稳定的增殖速率（倍增时间约11小时）、正常的核型以及多能性特征。早期传代（p30以下）和晚期传代（p50以上）的细胞在形态、标志物表达和增殖能力上均无显著差异，单细胞克隆效率约为15%。

图1 不同培养基中形成的克隆的明场图像

通过系统的因子去除实验，研究人员阐明了三种因子在维持细胞多能性中的不同作用。FGF2是细胞存活所必需的，缺失会导致细胞无法维持超过两代。WH-4-023的缺失会引起细胞形态变平，部分细胞开始出现原肠胚形成标志物EOMES的表达，同时上皮-间质转化（EMT）相关基因SNAI2和WNT5A显著上调，核心多能性基因POU5F1表达下降。IWR-1的去除则导致更严重的分化表型，绝大多数细胞丧失POU5F1表达并强烈表达EOMES，同时伴随EMT和原肠胚形成相关基因的广泛激活。这表明WNT通路抑制在防止pESC自发分化中发挥比SRC抑制更为关键的作用。

多向分化潜能验证实验充分证明了pESC-FIW的广泛发育潜能。体外胚胎体（EB）形成实验显示，在去除三种因子后，细胞能够自发分化为表达外胚层标志物Tubulin-βIII、中胚层标志物T以及内胚层标志物CK17的细胞。定向诱导分化实验进一步证实，在特定条件培养基作用下，pESC-FIW可以高效分化为神经外胚层（SOX1阳性）、中胚层（T阳性）和内胚层（GATA6阳性）细胞。体内畸胎瘤形成实验最终在免疫缺陷小鼠中观察到包含神经胶质、软骨和呼吸道上皮等代表三个胚层的组织结构，从功能上确证了pESC-FIW的全能性特征。

转录组学分析深入揭示了pESC-FIW的多能性状态特征。与已报道的其他猪多能干细胞系进行比较，热图分析显示pESC-FIW与pESC_Choi（同样使用FGF2和IWR-1培养）的基因表达模式最为相似，而与使用复杂培养基的FL6i_pESCLC_Yuan和体内胚胎来源的pgEpiSCs存在明显差异。主成分分析（PCA）进一步证实pESC-FIW与复杂培养基来源的pESC聚类在一起。更为关键的是，与猪胚胎不同发育阶段的转录组数据进行比较时，PCA结果显示pESC-FIW与E12-13期原肠胚形成阶段的胚胎最为接近。综合免疫标志物检测（KLF4阴性、OTX2阳性、T阴性）和基因表达分析结果，表明pESC-FIW虽然具有圆顶状形态和单细胞传代能力等类似原始态（naive）干细胞的特征，但其分子特征实际上更接近于形成态（formative）或始发态（primed）多能性状态，具体表现为原肠胚形成期上胚层细胞的特性。

在无饲养层培养条件的适应性研究方面，研究人员发现单纯将pESC-FIW转移至Matrigel包被的培养皿并使用FIW培养基，无法维持其多能性，细胞出现多能性标志物表达下降和分化相关基因上调的现象。通过筛选，发现商业培养基mTeSR能够有效支持pESC-FIW在无饲养层条件下的自我更新，其效果与饲养层条件相当。进一步比较四种细胞外基质（Matrigel、纤连蛋白、层粘连蛋白-521和VTN-N）发现，纤连蛋白在细胞贴附效率上优于Matrigel，而四种基质在细胞存活、增殖和多能性维持方面表现相似。基于纤连蛋白具有成分明确、批次间差异小的优势，研究人员最终确定以纤连蛋白作为Matrigel的替代物。实验还证实，ROCK抑制剂Y-27632对于单细胞传代后的细胞存活至关重要，而TrypLE是最高效的细胞解离试剂。在优化的无饲养层条件下（mTeSR培养基、纤连蛋白包被、ROCK抑制剂处理），pESC-FIW能够长期维持多能性标志物的均匀表达，并保持向三个胚层分化的能力。