预防性补充婴儿双歧杆菌或其代谢物肌苷可减轻心脏缺血/再灌注损伤

尽管心血管疾病（CVD）的治疗策略已取得长足进步，其仍是全球发病和死亡的主要原因，其中心肌梗死（MI）最为严重，且常并发缺血/再灌注（I/R）损伤——该损伤由MI治疗本身所致，约占最终梗死病例的一半。I/R损伤涉及代谢紊乱、炎症、氧化应激和微血管阻塞等多种复杂机制，亟需新型防治手段。近年来，肠道-心脏轴备受关注，肠道微生物及其代谢产物（如三甲胺、短链脂肪酸、胆汁酸和琥珀酸盐）不仅与高血压、心衰等CVD密切相关，还能通过调节T细胞、先天淋巴样细胞和巨噬细胞等免疫细胞影响宿主免疫炎症反应。尽管已有益生菌（如动物双歧杆菌、加氏乳杆菌、植物乳杆菌及新型菌种嗜黏蛋白阿克曼菌）在代谢性疾病中显示出潜力，但其在MI及I/R损伤中的保护作用尚不明确。双歧杆菌属在哺乳动物肠道中丰度较高，能改善便秘、腹胀等症状，其中婴儿双歧杆菌（B. infantis）被报道可缓解溃疡性结肠炎等炎症性疾病，且在冠状动脉疾病（CAD）患者中丰度显著低于健康人群，但其对心肌I/R损伤的影响仍属未知。本研究采用小鼠心肌I/R损伤模型，发现预防性给予婴儿双歧杆菌可减轻心脏损伤，其代谢产物肌苷通过协同抑制炎症和减少心肌细胞死亡发挥保护效应，提示婴儿双歧杆菌或肌苷有望成为防治急性心肌I/R损伤的候选药物。

文献采用了雄性C57BL/6J小鼠，先经7天抗生素处理清除肠道菌群（粪便16S rDNA拷贝数显著下降，p < 0.001），随后灌胃婴儿双歧杆菌7天，再行心肌缺血再灌注（I/R）手术。灌胃后粪便中婴儿双歧杆菌rDNA拷贝数显著增加（p < 0.001），表明菌株成功定植。与PBS灌胃的I/R组相比，婴儿双歧杆菌灌胃组的心脏重量/体重比和心脏重量/胫骨长度比均显著降低（p < 0.01或p < 0.001），且超声心动图显示，术后7天其左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）显著升高，左心室舒张末期内径（LVEDD）和收缩末期内径（LVESD）显著减小（p < 0.05，p < 0.01，*p < 0.001），表明心功能得到明显改善。

婴儿双歧杆菌灌胃可减少小鼠心脏缺血/再灌注（I/R）术后的心肌纤维化和细胞凋亡。I/R术后7天，通过心室中部切片的天狼星红染色（上图，红色区域代表胶原）和梗死边缘区Masson三色染色（下图，蓝色信号代表纤维化区域）评估心肌纤维化程度，结果显示婴儿双歧杆菌灌胃组的纤维化面积较PBS灌胃的I/R组显著减小（p < 0.01，p < 0.001）。同时，TUNEL染色（绿色）检测凋亡心肌细胞，200倍视野下凋亡细胞计数显示婴儿双歧杆菌灌胃组的凋亡细胞数显著减少（p < 0.01，p < 0.001）。此外，I/R术后3天血清心肌肌钙蛋白T（cTnT）水平检测显示，婴儿双歧杆菌灌胃组的cTnT水平显著低于PBS灌胃的I/R组（*p < 0.05，**p < 0.01）。上述结果表明，婴儿双歧杆菌预处理可有效减轻I/R诱导的心肌纤维化和细胞凋亡，降低心肌损伤标志物水平。

肌苷可重现婴儿双歧杆菌在小鼠心脏中抗心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的心脏保护作用。实验采用高效液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）检测发现，连续灌胃婴儿双歧杆菌7天后，小鼠血清中肌苷水平显著升高（p < 0.01），I/R术后14天心脏组织中肌苷水平同样显著升高（p < 0.001）。为验证肌苷的直接效应，研究者对雄性C57BL/6J小鼠在I/R术前腹腔注射肌苷7天，术后继续注射7天，并于术前和术后7天行超声心动图检测心功能，同时采集术后1天和7天的血清及心脏组织。结果显示，与PBS处理的I/R组相比，肌苷处理组的心脏重量/体重比（HW/BW）和心脏重量/胫骨长度比（HW/TL）均显著降低（p < 0.001），术后3天血清心肌肌钙蛋白T（cTnT）水平亦显著下降（p < 0.01或p < 0.001）。超声心动图定量分析表明，肌苷处理组左心室射血分数（LVEF）和短轴缩短率（LVFS）显著升高，左心室舒张末期内径（LVEDD）和收缩末期内径（LVESD）显著减小（p < 0.05至p < 0.001）。此外，术后7天Masson三色染色显示，肌苷处理组心脏纤维化面积较PBS处理组显著减少（p < 0.01或p < 0.001）。上述结果表明，肌苷能够有效模拟婴儿双歧杆菌的心脏保护效应，减轻I/R诱导的心功能损伤、心肌细胞坏死及纤维化。

转录组分析显示，肌苷处理可改善缺血/再灌注（I/R）术后小鼠心脏的能量代谢并抑制免疫反应。主成分分析（PCA）表明各处理组内样本聚类良好，组间重叠极小。火山图鉴定出假手术（Sham）与PBS+I/R组之间，以及肌苷+I/R与PBS+I/R组之间的差异表达基因（|差异倍数|>2，校正后p<0.05）。Venn图显示，部分在I/R术后上调、在肌苷处理后下调的基因，以及部分在I/R术后下调、在肌苷处理后上调的基因存在显著重叠，表明肌苷可逆转I/R诱导的基因表达异常。热图直观展示了上述被逆转基因的表达水平变化。基因本体（GO）生物学过程富集分析表明，肌苷处理后上调的基因（即I/R后下调的基因）主要富集于能量代谢相关通路；而肌苷处理后下调的基因（即I/R后上调的基因）则富集于免疫反应和炎症相关通路。基因集富集分析（GSEA）进一步证实，与PBS+I/R组相比，肌苷+I/R组中脂肪酸代谢相关基因集显著富集，而细胞因子产生的正向调控和细胞凋亡相关基因集则被显著抑制。综上，转录组学证据表明肌苷可通过改善能量代谢并抑制炎症及凋亡通路，发挥心脏保护作用。

肌苷通过激活抗炎性腺苷A2A受体减轻缺血/再灌注（I/R）术后心脏炎症。免疫组织化学染色显示，I/R术后心脏组织中促炎因子IL-1β阳性信号显著增加，而肌苷处理可明显降低IL-1β表达水平（p < 0.01或p < 0.001）。ELISA检测结果进一步表明，肌苷处理组在I/R术后1天和7天血清IL-1β和IL-6水平均显著低于PBS处理的I/R组（p < 0.05至p < 0.001）。流式细胞术定量分析显示，I/R术后7天，肌苷处理组心脏中中性粒细胞、CD11b+巨噬细胞、树突状细胞（DCs）和自然杀伤（NK）细胞数量均显著减少（p < 0.05或p < 0.01）。为验证肌苷是否通过腺苷A2A受体（A2AR）发挥作用，研究者联合使用A2AR抑制剂（ZM241385）。超声心动图结果显示，与单独肌苷处理组相比，联合使用A2AR抑制剂后，左心室短轴缩短率（LVFS）显著下降，左心室舒张末期内径（LVEDD）和收缩末期内径（LVESD）显著增加（p < 0.05至p < 0.001），且该组与PBS处理的I/R组之间无显著差异。同时，ELISA检测表明，A2AR抑制剂可逆转肌苷对血清IL-1β和IL-6水平的抑制作用（p < 0.05或p < 0.001）。以上结果提示，肌苷通过激活A2AR发挥抗炎作用，进而改善I/R后的心脏功能。

肌苷通过嘌呤补救途径作为ATP生成的替代碳源，减轻心脏细胞死亡。TUNEL染色显示，肌苷处理组小鼠心脏梗死边缘区凋亡心肌细胞数量较PBS处理的I/R组显著减少（p < 0.001）。体外实验中，C2C12成肌细胞经氧糖剥夺/复氧（OGDR）处理模拟I/R损伤，不同浓度肌苷处理可显著提高细胞活力（p < 0.01或p < 0.001），且PI/Calcein-AM染色显示肌苷显著减少死细胞数量（p < 0.001）。进一步通过siRNA敲低嘌呤补救途径相关基因后，肌苷的保护作用被显著削弱（p < 0.001），表明该通路是肌苷发挥保护作用所必需。在OGDR条件下，肌苷处理可显著升高C2C12细胞内AMP水平（p < 0.001），并在嘌呤补救途径抑制剂存在时仍能维持ATP水平（p < 0.001），提示肌苷可作为替代碳源供给能量。在体内，肌苷处理组小鼠心脏组织在I/R术后多个时间点的ATP水平均显著高于PBS处理组（p < 0.05至p < 0.001），尤其在术后30分钟和24小时，肌苷组ATP水平显著升高（p < 0.01或*p < 0.001）。上述结果表明，肌苷通过嘌呤补救途径为受损心肌提供ATP，从而减轻细胞死亡。

婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）可对心肌缺血/再灌注（I/R）损伤发挥心脏保护作用，且其代谢物肌苷可重现该效应。具体而言，肌苷通过减少I/R后促炎细胞因子的产生并降低树突状细胞和自然杀伤细胞的数量，从而抑制心脏炎症；此外，肌苷可在应激心肌细胞及I/R损伤小鼠心脏中，作为嘌呤补救途径中三磷酸腺苷生成的替代碳源，从而减轻细胞死亡。综上所述，婴儿双歧杆菌或其代谢物肌苷对I/R具有多效性心脏保护作用，提示其可作为急性缺血性心脏损伤的预防性治疗选择。

参考资料：Timmis, Adam, Panos Vardas, Nick Townsend, Aleksandra Torbica, Hugo Katus, Delphine De Smedt, Chris P. Gale, et al. 2022. “European Society of Cardiology: Cardiovascular Disease Statistics 2021.” European Heart Journal 43: 716–799. （https://doi.org/10.1093/eurheartj/ehab892）