核心提示：抗生素耐药性（AR）的遗传决定因素已被广泛研究。高通量测序能够评估基因型和表型之间的关系。研究对672株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa, P.ae），包括多重耐药（MDR）和泛耐药（XDR）菌株进行基因组分析，并将最低抑菌浓度（MIC）值的变化与耐药性数据相关联，完成一项临床相关抗生素的耐药性关联研究（Resistome-wide association study, RWAS）。
基因组序列研究有助于检测现有的和定义新的细菌耐药性，并能够通过已知的基因型耐药谱有效地预测表型耐药谱，从而指导临床抗生素用药。现今，一些大型数据库，尽管收集了近乎完整的AR遗传因素，但数据库的可靠性仍然需要科研人员展开实验进行充分验证。另外，AR基因及其多态性的存在与表型抗性数据并不具有直接关联性。因而，梅里埃公司研究人员Magali Jaillard等人针对铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P.ae)做了一项研究，内容主要为：1)发现新的AR基因/突变位点;2)在已知的/新发现的AR基因/突变与耐药表型之间建立关联性。
首先，作者对672株临床P.ae(包括MDR和XDR)开展了耐药特征分析(图1)，根据相应的耐药表型分析了其所含的AR基因，区分了核心耐药基因和附属耐药基因。在这里，发现药物外排和孔蛋白相关的耐药机制主要是固有的，而与抗生素失活相关的耐药性(美罗培南)是获得性的(AR基因/SNPs位点更多位于附属基因)，且观察到较多整合子(红色)出现在附属基因中。因而，研究统计了整合子出现的频率(34.1%)，并观察到了AR基因的富集。研究给出了整合子的16种基因盒组成情况，并在系统发育树上给出了它们的分布情况(多样性)，展示了耐药性水平转移的证据，详见图2.然后，研究将9种抗生素表型(MIC值)与AR基因存在与否(图3A)及基因突变(图3B)联系起来，表征了基因型与耐药表型间的关联性。在这里，研究还发现了一些新的与耐药表型具有显著相关性的AR基因及突变位点。可以观察到，P.ae对美罗培南MIC值的升高主要与oprD基因及其多态性相关。
在全球范围内，如果AR基因及相关突变在具有耐药表型的分离株中以足够的频率出现，则其预测相关性就有较高的参考价值。本研究搭建的统计学方法框架有助于探索新的基因型-表型关联性研究，如oprD的两个突变导致一个终止密码子过早出现，使得美罗培南MIC值上升。本文证明了生物信息学在抗性基因含量的分类价值，整合子组成特征和RWAS对检测(新的)抗性标志物(AR基因/的价值，但是后续还需使用表型明确的菌株进行进一步分析、验证。
图1 672株P.ae的耐药表型和基因组信息。上图显示了菌株对研究的几种抗生素的耐药情况(绿色)，图中的紫色阴影表示菌株的主要3种序列分型(ST235.ST111.ST175)，下方展示了每一株菌的基因组大小(5.5-7.5 Mb，中位数：6.72 Mb)。下图则显示了研究从基因组中找出的已知的耐药基因和非同义SNPs(总数：147)。图中列出了对应表型下找出的耐药基因和非同义SNPs的名称，变异的作用机制(外排泵/孔蛋白;酶失活等)以及其对MIC值的影响(+/-)，并显示了含有这些耐药基因/SNPs的菌株的百分比，区分了核心基因和附属基因。从图中可以看出，147个致耐药因子涵盖了5种耐药机制，包括固有和获得性耐药。其中，与药物外排和孔蛋白相关的耐药性主要是固有的，而与抗生素失活相关的耐药性是获得性的。
图2 P.ae的第1类整合子(Intl1)组成分析。(A)整合子的出现频率(34.1%)，AR基因含量(63.9%，Intl1上游10 kb以内)及AR基因在整合子中是否存在富集效应。(B)主要基因盒In51的基因顺序及发生频率。(C)最常见的Intl1整合子的构型(AR基因的组成)，其中基因盒In51(n = 27)只包含sul1和aadA6 AR基因。(D)基因盒在系统发育树中的分布情况。可以看到，部分基因盒会根据序列类型(ST)聚类，而部分基因盒分布无规律。
图3 耐药性关联性分析(RWAS)结果表征。(A)统计了已知/新发现的耐药基因在不同耐药表型下的出现情况，建立了其表型-基因型的关联性(显著/不显著)。(B)关注基因内的突变(5种性质)。可以观察到oprD基因及其多态性是P.ae—美罗培南AR的决定因素。
论文DOI：10.1016/j.ijantimicag.2017.02.026
