核心提示：金黄色葡萄球菌和粪肠球菌同时存在时，可以增加细菌生物膜总量。在粪肠球菌中，有氧呼吸既需要外源血红素激活cydAB编码的依赖血红素的细胞色素bd，也需要O2的存在。

  摘要：金黄色葡萄球菌和粪肠球菌通常在医院内生物膜的相关感染中伴随出现，其生物膜对毒力的贡献以及阻碍治疗的作用是公认的。尽管经常被同时分离，它们生物膜在形成过程是否存在相互作用尚未得到很好的解释。本文发现，金黄色葡萄球菌和粪肠球菌同时存在时，可以增加细菌生物膜总量。在粪肠球菌中，有氧呼吸既需要外源血红素激活cydAB编码的依赖血红素的细胞色素bd，也需要O2的存在。研究确定cydDC编码的ABC转运蛋白有助于血红素输入。在两种细菌同时存在时，金黄色葡萄球菌提供血红素可以激活粪肠球菌的有氧呼吸。血红素合成缺陷的金黄色葡萄球菌突变体不能增强生物膜形成，而单独的血红素也可以增强粪肠球菌单物种生物膜的形成。粪肠球菌明胶酶的活性促进了从血蛋白中提取血红素。这种不同细菌种类间相互作用和代谢交叉摄食可以解释这些微生物在生物膜相关感染中共存的原因。

  引言

  生物膜是细菌生命抵抗外界不利条件的主要屏障，生物膜在外界环境条件变化、生理应激、抗生素介导的清除时等对细菌有保护作用，这使得生物膜的相关感染治疗困难。粪肠球菌和金黄色葡萄球菌都是机会性病原体，都有很高的生物膜形成潜力，两者都与生物膜相关的感染有关，如心膜炎、尿路感染和慢性伤口等。粪肠球菌自身不能合成卟啉进入TCA循环，不能合成血红素，粪肠球菌的有氧呼吸需要外源性血红素作为细胞色素bd的辅助因子。细胞色素bd是粪肠球菌的关键呼吸酶，含有两个亚基(CydA和CydB)，具有三种细胞色素b558、b595和d。此外，cydC和cydD是细胞色素bd发挥作用所必需的，被认为参与血红素运输和/或细胞色素bd组装。尽管粪肠球菌和金黄色葡萄球菌常在慢性伤口中伴随出现，如糖尿病足溃疡、静脉腿溃疡和压力伤口，但对其相互作用的研究主要局限于临床环境中万古霉素耐药基因从粪肠球菌转移到金黄色葡萄球菌。在这项研究中，探讨了粪肠球菌和金黄色葡萄球菌在生物膜形成过程中的相互作用机制。

  结果

  金黄色葡萄球菌增强粪肠球菌生物膜的生长和总量的积累

  由于金黄色葡萄球菌和粪肠球菌在生物膜相关感染中经常被共同分离，文章首先研究了双物种共同生长对生物膜总量积累的影响。使用改进的结晶紫染色法测定生物膜生物量，结果发现，粪肠球菌(OG1RF)单独生长时，生物膜生物量在第1天达到峰值，在剩余的四天内趋于稳定;金黄色葡萄球菌(菌株USA300LAC)形成的生物膜较少(图1A)。

  为了确定双物种共同生长的增加是否有助于增加细菌生物量，手动破坏生物膜并确定单物种和双物种的生物总量(CFU)。第5天观察到，与单物种相比，双物种生物膜中粪肠球菌的生物量显著增加了5倍，粪肠球菌的生物量比金黄色葡萄球菌多约60倍。且从相同膜孔中取样(浮游)的生物量没有显著差异，表明金黄色葡萄球菌对粪肠球菌的生长和生物膜形成的增强是特有的(图1C)。

  图1 A：结晶紫染色法测定96孔板中金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的生物膜总量B：破坏A形成的生物膜，5天后测定新形成的生物膜总量C：测定金黄色葡萄球菌或粪肠球菌或两者的浮游生物量

  双物种生物膜增强依赖于特定菌株

  为了研究金黄色葡萄球菌对粪链球菌的生物膜的增强是否是菌株(E. faecalis strain OG1RF and S. aureus strain USA300LAC)特有的现象，选取了另外五种常用的金黄色葡萄球菌菌株以及十种临床分离株进行测试。结果发现，在16种金黄色葡萄球菌菌株中，有14种在与粪肠球菌OG1RF共培养时显示出显著的生物膜总量增加(图2A)。Newman菌株和分离株C37没有增加生物膜总量。

  接下来，测试另外三种粪肠球菌实验室菌株和28种来自血液(VRE分离株)、伤口感染株(TTSHW-EF05至EF43)、尿路感染(UTIEF分离株)或儿童健康胃肠道(HCG分离株)的临床分离株，探究粪肠球菌菌株差异是否也会影响双物种生物膜增强。32种菌株中只有6种显示出强化生物膜形成(图2B)。在这六种菌株中，增强程度在2.06-3.10倍之间。在其余的26种菌株中，17个显示出低于OG1RF的单物种生物膜水平，5个具有高生物膜水平，4个生物膜水平与OG1RF相似。得出结论，许多粪肠球菌分离株不易受到USA300LAC生物膜强化的影响，表明菌株差异(不仅仅是物种组成)深刻影响微生物间的相互作用。

  图2 A:粪肠球菌(OG1RF)与六株金黄色葡萄球菌实验室菌株(USA300LAC-ISP479)和十株临床分离株(C01-C50)单独培养或共同培养五天后，测定生物膜总量B：金黄色葡萄球菌(USA300LAC)与四种实验室粪肠球菌菌株(OG1RF-V583)和28株临床分离株(VRE122-TTSHW-EF43)单独培养或共同培养五天后，测定生物膜总量

  粪肠球菌转座子筛选确定menA和cydA对双物种生物膜增强至关重要

  本文验证了七个特定基因中的九个突变体，其中粪肠球菌的epaOX转座子突变体和缺失突变体均显示双物种生物膜水平相对低于单物种对照组水平，在质粒补充菌株中恢复到亲本菌株水平。epaOX有可能通过EPS过程参与双物种生物膜形成的增强。转座子筛选中确定的四种其他经验证的基因产物(ABC转运蛋白，SufB、RpiR和Ser/Thr磷酸酶，图3A)的作用未被深入探究。某些研究中提出sufB的重要性，其通过FeS簇组装参与呼吸过程值得关注。作者鉴定了menA(OG1RF_11661)和cydA(OG1RF111666)转座子突变体，它们未能增强双物种生物膜的形成。但这两个基因都是编码参与氧化呼吸的蛋白质(图3B)，有必要对这一过程进行更深入的研究。

  图3 A亲本菌株(OG1RF)和九个转座子突变体(圆形)或与金黄色葡萄球菌(USA300LAC，三角形)共同培养五天，测定生物膜水平B 粪肠球菌的氧化呼吸需要MenA、CydA、CydB、血红素和O2的参与

  金黄色葡萄球菌通过血红素和血红蛋白增强粪肠球菌OG1RF生物膜需要O2和cydABCD

  作者假设粪肠球菌的有氧呼吸对于双物种生物膜增强是必要的。验证实验发现，在缺氧条件下没有观察到双物种生物膜增强(图4A)，但在有氧条件下增加了2倍以上(图4B)，表明双物种生物膜合成增强需要氧气的参与。

  粪肠球菌的有氧呼吸依赖细胞色素bd，需要外源性血红素作为辅助因子，本文研究血红素和结合血红素(血红蛋白)对粪肠球菌生物膜形成的影响。有氧条件下，补充任一血红素来源均可显著增加两倍以上的生物膜生物量(图4B)，并伴随着耗氧量的增加。在缺氧条件下，补充血红素对生物膜水平的影响最小，补充血红蛋白没有影响(图4A)。

  图4 在缺氧(A)和有氧(B)条件下，粪肠球菌在金黄色葡萄球菌(Sa)、血红素或血红蛋白(Hb)存在下培养五天，测定生物膜总量

  操纵子(图5A)包括cydC和cydD，它们编码表达功能性细胞色素bd复合物所需的ATP结合盒(ABC)型转运蛋白。在所有测试转座子突变体(cydB，cydC和cydD)中，血红素和金黄色葡萄球菌的生物膜增强效果均显著减弱(图5A)，表明增强作用需要功能性操纵子。粪肠球菌cydB和cydD的缺失突变体菌株即使在血红素和金黄色葡萄球菌存在下同样未能增强其生物膜形成，在质粒补充后菌株恢复了增强效果(图5A)。此外，menA转座子突变体中，缺乏血红素或血红蛋白诱导的生物膜增强，表明需要去甲基萘醌才能发生氧化呼吸(图5A和3B)。

  在补充有血红素的TSB中培养粪肠球菌时检测到血红素，在对照组中未检测到血红素(图5B)，与粪肠球菌无法合成血红素一致。在补充血红素的TSB中生长，细胞内血红素在任何cyd突变体菌株中都未检测到(图5B)，表明该操纵子对于血红素摄入至关重要。所以，粪肠球菌的有氧呼吸被血红素、血红蛋白或金黄色葡萄球菌激活，导致生物膜形成增强，并且粪肠球菌摄入血红素是由CydDC介导的。

  图5 A:cydA，cydB，cydC，cydD和menA的转座子突变体，cydB和cydD的缺失突变体，它们的互补菌株以及亲本菌株OG1RF，在血红素(25μg/ ml)存在下单独培养，或与金黄色葡萄球菌共同生长五天，定量测定生物膜B：血红素(5μg/ml)，cydA，cydB，cydC，cydD和menA的转座子突变体，cydB和cydD的缺失突变体，它们的互补菌株以及亲本菌株OG1RF过夜培养，通过LC-MS沉淀，裂解分析细胞内血红素

  金黄色葡萄球菌的血红素生物合成是双物种生物膜增加的原因

  本文试验了可能介导血红素合成的四个基因(hemA、hemB、hemE和hemL)，结果发现，只有hemB突变体的金黄色葡萄糖菌株显示出生长缺陷，在补充血红素后恢复生长水平。hemB突变体是唯一个显示菌株细胞内血红素减少40倍的突变体，也是这四个基因中唯一的血红素缺陷突变体。在血红素合成方面存在缺陷的金黄色葡萄球菌hemB突变体菌株没有产生增强的生物膜形成效果(图6)，表明金黄色葡萄球菌和粪肠球菌共同存在时双物种生物膜的形成增强依赖于金黄色葡萄球菌中的血红素生物合成。

  由在金黄色葡萄球菌生物膜形成过程中，AtlA对细胞溶解是必要的。当粪肠球菌和金黄色葡萄球菌atlA转座子突变体共培养时，它们产生的生物膜少于粪肠球菌与金黄色葡萄球菌亲本菌株共培养时的生物膜，但与仅粪肠球菌对照相比，生物量仍显著增加(图6)。这表明AtlA能够促进金黄色葡萄球菌释放血红素，但不是必需的。

  图6亲本菌株金黄色葡萄球菌USA300LAChemB转座子突变体和atlA转座子突变体单独生长或与粪肠球菌组合生长五天，定量测定生物膜

  粪肠球菌内明胶酶E(GelE)参与使用由金黄色葡萄球菌合成的血红素

  金黄色葡萄球菌株不能增强缺乏明胶酶活性的粪肠球菌OG1X生物膜的形成能力(图2B)。粪肠球菌突变株OG1RFΔgelE的生物膜显著增加仅发生在补充血红素期间，而不是金黄色葡萄球菌或血红蛋白补充期间(图7)。游离血红素(血红素)，而非结合血红素(血红蛋白)可用于增强ΔgelE突变体菌株中的生物膜的合成。此外，在金黄色葡萄球菌株USA300LAC存在下，ΔgelE突变体菌株无法增强生物膜的形成能力(图7)，表明USA300LAC产生的血红素也是一种结合的血蛋白形式。

  图7 粪肠球菌(OG1RF)和各自的凝胶酶缺失突变体(∆gelE)单独生长或与血红素(25μg/ ml)、血红蛋白(10μg/ ml)或金黄色葡萄球菌(USA300LAC)组合生长五天，定量测定生物膜。

  结论

  研究发现金黄色葡萄球菌可通过释放血红素供粪肠球菌呼吸使用，促进粪肠球菌生长并增加其生物膜总量。在大多数情况下，血红素的交互供养(可能以分泌血蛋白的形式)将需要明胶酶介导的血红素被粪肠球菌获取。项研究使我们对粪肠球菌血红素稳态平衡有了更完整的概念，即粪肠球菌依赖外源性血红素作为血红素依赖酶(细胞色素bd CydAB、过氧化氢酶)的辅助因子，同时也利用血红素感应调节器(FhtR)和血红素输出(HrtAB)以避免血红素中毒。在对CydABCD复合体研究中，观察到即使在高血红素的培养基中，突变株若存在任一cydA (细胞色素bd亚基)、cydC或cydD (ABC型转运蛋白跨膜蛋白)失活，细菌内部血红素量将微乎其微。不过，虽然CydDC已经被证实在血红素摄取中起着重要作用，但可能并不是唯一的途径，例如先前研究发现cydABDC基因复合体的失活不能消除血红素依赖的过氧化氢酶的活性。事实上，细菌间转运体功能重叠是相当普遍的，因此对血红素稳态平衡机制还需要有更多的研究和探索。

  参考文献

  Ch'ng J, Muthu M, Chong K, et al. Heme cross-feeding can augment Staphylococcus aureus and Enterococcus faecalis dual species biofilms[J]. The ISME Journal, 2022,16(8): 2015-2026.