核心提示：肠道微生物组产生许多代谢物，包括短链脂肪酸(SCFAs)，如醋酸(AA)、丁酸盐(BA)和丙酸盐(PA)。SCFAs又通过几个不同的机制向肠道及以后的宿主细胞发出信号。
摘要：肠道微生物组产生的代谢物与芳烃受体(AhR)相互作用，是肠道内免疫同质化的一个关键调节因素。作者发现，口服氧化石墨烯(GO)可以调节成年斑马鱼的肠道微生物组的组成，在野生型动物和有ar2缺陷的动物中存在明显的差异。此外，当与短链脂肪酸丁酸盐结合时，发现GO能引起AhR依赖性的cyp1a诱导，并使lck+细胞在无胚芽斑马鱼幼虫的肠道内归位。为了进一步了解对GO的免疫反应，作者使用单细胞RNA测序法对整个无胚层的细胞以及富含lck的细胞进行剖析。这些研究为无胚芽斑马鱼中存在先天淋巴细胞(ILC)样细胞提供了证据。此外，被赋予微生物丁酸盐的冠状动脉的GO触发了具有调节细胞属性的ILC2样细胞的诱导。综上所述，本研究表明，纳米材料可以以一种依赖于AhR的方式影响微生物组和免疫系统之间的串扰。
日益开发包括石墨烯基材料在内的纳米材料，需要全面评估这些材料对人类健康的潜在影响。然而，尽管纳米材料与免疫系统的相互作用已有相应解释，但它们对宿主的微生物组的影响仍有待探究。此外，还需要研究石墨烯基材料或其他纳米材料是否通过对微生物群或其代谢物的影响来调节免疫反应。
微生物组，即人类“被遗忘的器官”，参与了宿主中多种信号通路的调节，肠道微生物组和免疫系统之间存在双向的交流。肠道微生物组产生许多代谢物，包括短链脂肪酸(SCFAs)，如醋酸(AA)、丁酸盐(BA)和丙酸盐(PA)。SCFAs又通过几个不同的机制向肠道及以后的宿主细胞发出信号。最近的研究表明，BA调节肝脏和肠道中的芳烃受体(AhR)及其目标基因(包括编码细胞色素P450家族成员的基因，如CYP1A1)，而其他研究则将BA与AhR表达的调控或其他AhR配体的表达联系起来。AhR控制肠道上皮细胞的再生，介导抗炎反应并调节3型先天淋巴细胞(ILC3)的极化。AhR的激活也有利于诱导耐受性调节T细胞(T regs)，最近的一项研究表明，AhR途径调节胃肠道(GI)ILC3的ILC2平衡，以确保对病原体有适当的免疫反应。因此，肠道微生物群的改变可能导致AhR配体库的变化，从而影响宿主的肠道免疫。
图1 成年斑马鱼肠道微生物组的AhR依赖性变化。a, 成年斑马鱼七天暴露方案的实验设计(WT和ahr2+/−)。b, 基因型和治疗中肠道微生物群最丰富的细菌门。c, d, Fusobacteriota (c)和Proteobacteria (d)在WT中与暴露于GO的arh2+/−鱼的相对门类丰度。e，对两种基因型之间的微生物群组成进行监督分析。f, g, GO对WT(f)和ahr2+/−(g)斑马鱼的肠道微生物群组成的影响。
在这项研究中，作者使用斑马鱼(Danio rerio)作为模型，首先确定了石墨烯氧化物(GO)是否可以调节肠道微生物群的组成，以及AhR是否在塑造未暴露或暴露的动物的微生物群方面发挥了作用。在暴露动物之前，GO被确定为无内毒素。将野生型(WT)和AhR缺陷的斑马鱼连续暴露在GO(50或500 μg l-1)中7天，此时解剖肠道，采集样品，进行16S rRNA基因测序(图1a)。解剖肠道的透射电子显微镜(TEM)表明GO存在于与细菌混合的肠道中。高倍率图像显示GO片与微绒毛紧密结合(低剂量)和GO的细胞摄取迹象(高剂量)。粘膜屏障处的上皮细胞是免疫的第一道防线，而杯状细胞(分泌粘蛋白的上皮细胞)的增生是2型免疫的标志。作者使用阿尔新蓝和高碘酸-希夫试剂测定杯状细胞的表达，并观察到暴露于GO(50 μg l-1)的动物中杯状细胞显着增加。此外，16S rRNA基因测序显示，在WT和AhR缺陷(ahr2+/−)的斑马鱼中，Proteobacteria和Fusobacteriota在肠道微菌群中占主导地位(图1b)。暴露于GO会使相对丰度从Fusobacteria转移到Proteobacteria，这种影响在AhR缺陷的动物中更为明显(图1c,d)。有趣的是，16S rRNA基因测序显示，小鼠口服GO后，Firmicutes与Bacteroidetes的比例有明显变化(七天内每天2.5 mg kg−1)。目前的数据显示，肠道微生物群的组成在两种基因型(R2，21%;p = 0.0004)和暴露组(R2，26%，p = 0.0001)之间有显著差异(图1e)。GO暴露解释了WT动物中微生物群组成变化的46%(图1f)，而在AhR缺陷的动物中，GO暴露解释了34%的变化(图1f，g)。值得注意的是，在WT动物中，高剂量暴露导致弧菌，假单胞菌和气单胞菌的富集，与先前对已知AhR激动剂的研究一致，而在AhR缺陷的动物中，在低剂量和高剂量组中都注意到类似的效果。然而，肠道微生物群单个成员的相对丰度并不一定与它们的免疫调节作用相关。雌性和雄性之间没有注意到ASV丰度的差异。相反，另一项研究发现，慢性暴露(25天)到高剂量(5 mg l-1)的GO会引起雌性和雄性斑马鱼在门和属水平上的差异。总之，一周的GO暴露极大地影响了成年斑马鱼的肠道微生物群组成，而斑马鱼的肠道微生物群又被AhR调节。
为了进一步研究微生物组的重要性，作者在WT和AhR缺陷的背景上生成了无胚芽(GF)的斑马鱼胚胎。此前的研究表明，来自成年斑马鱼肠道的细菌群落合成了所有三种主要的SCFAs，而且BA也被原地检测到(在成年斑马鱼中)。重要的是，使用人类肠道上皮细胞HT-29，发现只有BA(没有AA或PA)能够激活AhR。同样地，其他研究也表明BA在HT-29细胞中诱导了CYP1A1的表达。使用TEM还可以证明GO(30 μg ml-1)被24小时暴露后的分化HT-29细胞内化，这与之前的研究相反，其中分化的Caco-2细胞被用来模拟肠道屏障。因此，GO在体外和体内被肠道细胞吸收(如上所示)，因此可以起到向这些细胞输送BA的作用。GF斑马鱼幼龄期(受精后5天(dpf))与GO(5 μg ml-1)暴露24小时，从而导致消化道内有GO存在，TEM、拉曼光谱和显微镜证明了这一点(图2a，b)。TEM分析显示，GO位于上皮细胞微绒毛的表面。尽管注意到一定程度的微绒毛和上皮细胞膜损伤，但GO暴露并没有对消化道的整体结构产生不利影响。然后，我们使用反转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)监测作为AhR激活标志物的cyp1a的诱导。为此，胚胎在24小时内以指定的浓度暴露于GO(10、30和50 μg ml-1)、BA(0.5、1.5和2.5 mM)或GO和BA的组合(GO+BA)。我们使用高亲和力的AhR配体6-甲酰林多洛[3,2-b]咔唑(FICZ)作为阳性对照。FICZ在传统胚胎(CV)和GF胚胎中引发了明显的cyp1a诱导，这在ahr2−/−胚胎中被抵消了(图2c)。GO和BA，单独或结合起来，在CV胚胎中没有影响或影响不大。相反，在GF胚胎中，对GO+BA的综合暴露引发了对cyp1a的显著(约20倍)诱导，而这在ahr2−/−胚胎中则没有(图2d，f)，这证实了AhR的作用。我们还利用了在GF条件下得出的转基因Tg(cyp1a:GFP)斑马鱼，可以表明GO+BA在GI上皮中诱发了cyp1a诱导(图2g)，而在肠道内检测到红色荧光的BA。FICZ还促使肝脏和肠道诱发cyp1a，而单独使用BA或单独使用GO的反应则不那么明显。
此外，作者还考虑单独的GO或结合微生物代谢物BA是否会在斑马鱼胚胎中引起免疫反应(图3a-d)。作者观察到在暴露于GO+BA的GF胚胎中，lck(淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶)有超强的诱导作用(约60倍)，而对GO或BA都没有任何单独的影响。在CV胚胎中，情况并非如此，在AhR缺陷的斑马鱼中也没有发现lck的诱导。此外，在GF斑马鱼中，AA和PA(单独或与GO结合)都没有上调lck(图3e)。由于在5 dpf下应用胚胎，其处于幼龄阶段，免疫反应可能主要归因于先天的免疫系统。因此，GO+BA触发了lck的诱导，这是一个分子标记，所有三个先天淋巴细胞(ILC)亚型都以严格依赖AhR的方式共享，这只在GF斑马鱼中观察到。此外，基因表达谱显示，转录因子基因，即gata3和stat6，以及细胞因子编码基因，即il4和il13，对应于ILC2细胞在GF胚胎中上调，而与ILC1(tbet, ifn-γ)和ILC3(rorca, il22)细胞相关的基因则没有被上调。为了确认lck的诱导作用，转基因Tg(lck:GFP)斑马鱼幼虫在CV和GF条件下被暴露在GO+BA中。作者发现，GO+BA促使lck+细胞归位到肠道(图3f)。这只在GF斑马鱼中观察到(图3g)。
重要的是，最近的一项单细胞转录分析显示，成年斑马鱼的肠道中存在ILC样细胞。然而，在qPCR对基因表达进行批量分析的基础上赋予特定的细胞表型是具有挑战性的。因此，为了识别斑马鱼胚胎中的ILC样细胞，并推测GO+BA对这些细胞的影响，作者对整个胚胎的细胞以及富含lck的细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。为此，作者收集了来自WT胚胎的细胞和从Tg(lck:GFP)胚胎中富集出来的lck+细胞，这些细胞在GF条件下生长，并暴露在GO+BA下或不暴露，并使用10x基因组学技术进行scRNA-seq测序分析。对整个斑马鱼胚胎的转录组学分析能够在对照样本中用T细胞和ILC的标记来识别lck+细胞群，而在GO+BA暴露的斑马鱼中，识别了两个独立的lck+细胞群，其中一个对应于T细胞，另一个对应于ILC样细胞。此外，对这两个样本的综合分析显示，在GO+BA暴露的幼虫中，表达胰腺和肝脏标志物的细胞群扩大了。这可能意味着肠道中SCFAs的GO与冠状动脉的存在被感知为食物的诱导，导致编码消化酶(例如丝氨酸蛋白酶)的基因和参与脂质代谢的基因的诱导。同时，cyp1a是在暴露于GO+BA的GF胚胎中被确定为肠道细胞的集群中诱导的，这与Tg(cyp1a:GFP)斑马鱼获得的结果一致。然而，ILCs只包括存在于粘膜屏障的一小部分淋巴细胞。因此，为了完善方法，作者对从GF Tg(lck:GFP)幼虫中分离出来的lck+细胞进行了scRNA-seq。分析表明，在对照组中存在一个显示ILCs标志物的独特的细胞群(集群)(图4a)，与之前的研究一致，在成年斑马鱼的解剖肠道中发现了ILC样细胞。相关基因显示在图4b，红框划定了群集4(对应于ILC-like单元)。此外，在暴露于GO+BA时，可以确定一个与ILC样细胞相对应的集群(图4c)，而这些细胞又被证明由ILC2样细胞(nitr+ gata3+ il4+ il13+)和ILC3样细胞(nitr+ rorc+ il17a/f1+ il22+)以及ILC2细胞组成，其调控ILC样细胞的属性被称为ILC210细胞(nitr+ gata3+oxp3a+ il10+)(图4d)。GO+BA暴露的幼虫中类似ILC的星团的特征图(图4c,d，组8)。作者注意到，尽管假设存在一个调节性的ILC群体，但这样的细胞(即表达FOXP3的ILC子集)到目前为止还没有在小鼠或人类中被识别出来。然而，产生IL-10的ILC2细胞已经与调控活动相关。因此，需要注意的是，作者在GF斑马鱼中发现了一个细胞子集，其中有ILC2细胞的标记以及il10和foxp3。这些细胞也被发现表达il1rl1(也称为st2)，编码IL-33的受体。以前对小鼠的研究表明，产生IL-10的ILC2细胞可以在IL-33和视黄酸等警报素激活后产生。然而，斑马鱼基因组中没有编码IL-33的基因，人们可以推测到另一个类似WILIL-33的因子可能被涉及。因此，我们的研究为斑马鱼胚胎中存在ILC样细胞提供了证据，并表明暴露于GO+BA的GF斑马鱼ILC系内存在可塑性。需要进一步的研究来对这些细胞进行功能上的描述。
图2 GO加BA触发了GF斑马鱼中依赖AhR的CYP诱导。a, 通过TEM分析可视化的GO。比例尺，1 μm。b、光镜((i)和(ii))和拉曼共聚焦映射(iii)来验证肠道中是否存在GO。c, d, cyp1a在WT-CV(c)和WT-GF(d)幼虫中的相对mRNA表达。e, f, ahr2−/− CV (e) 和 ahr2−/− GF (f) 幼虫中cyp1a的相对mRNA表达。g, 在GF条件下诱导cyp1a的可视化。比例尺，50 μm。
以前对小鼠的研究表明，AhR在肠道ILC3s的维持和功能中起作用。然而，GF条件并不影响后者细胞的发育。在这里，作者发现了肠道免疫的一个新的方面，即纳米材料(GO)与微生物代谢物(BA)相结合，被证明在GF斑马鱼中引起AhR依赖的2型免疫反应，诱导ILC2样细胞显示调节细胞的能力。总之，本研究表明，GO会影响串扰在肠道微生物组和免疫系统之间，诱导出一个2型免疫反应。2型免疫力最出名的是它对寄生虫感染的保护作用，以及它在哮喘等过敏性疾病中的致病作用。这个发现意味着，免疫系统将GO+BA作为一种病原体。这对理解石墨烯基材料和其他纳米材料的巨大潜力有重要影响，并将AhR置于肠道微生物组和先天免疫系统之间双向交流的纽带。
图3 GO加BA触发了GF鱼中lck+细胞的AhR依赖性归位。在WT-CV(a)、WT-GF(b)、ahr2−/−-CV(c)和ahr2−/−-GF(d)中，仅在暴露于GO、BA或GO+BA的指定浓度下，lck的相对mRNA表达。e, 暴露于WT-GF斑马鱼幼虫的GO和/或各种SCFA后，lck的PCR分析。f, 量化归位于肠道的lck+细胞。在GF条件下，GO+BA暴露观察到肠道中lck+细胞的明显增加，但在CV斑马鱼中没有。g, 使用Tg(lck:GFP)斑马鱼幼虫在CV和GF条件下暴露的lck+细胞的可视化，如下所示。(i) CV鱼(对照)，(ii) CV鱼(GO+BA)，(iii) GF鱼(对照)，(iv) GF鱼(GO+BA)。比例尺，100 μm。
图4 scRNA-seq分析从GF斑马鱼收集的lck+富集的细胞。a, c, 10x RNA-seq数据的tSNE分析的二维投影，显示对照组(a)和GO+BA暴露的胚胎(c)中lck+细胞的异质性。b、d、点图显示了对照组(b)和GO+BA暴露的幼虫(d)中每个集群的目标基因的平均表达水平。圆点的大小表示集群内表达有关基因的细胞的百分比。红色方框划定了GO+BA暴露的鱼(d)中控制组(b)和组8(ILC类细胞)的第4组(对应ILC类细胞)。e, GO+BA暴露的幼虫(c和d中的组8)中ILC-like群组的特征图，反过来，它又被证明包括ILC2-like细胞(nitr+ gata3+ il4+ il13+)和ILC3-like细胞(nitr+ rorc+ il17a/f1+ il22+)，以及具有调控ILC-like细胞(ILC2 10个细胞)属性的ILC2细胞。
文章相关信息：
期刊名：nature nanotechnology
IF：40.523
大类：工程技术1区
小类：材料科学1区
DOI：10.1038/s4165-022-01260-8
出版时间：12 December 2022
文献类型：Letter
