核心提示：外排泵的空间结构决定了外排泵抑制剂与其结合的特征，结合位点的不同位置、不同氨基酸突变都会影响结合位点空间特性，进而影响外排泵抑制剂EPI的结合，使其临床疗效发生改变。

  细菌外排泵(efflux pumps)是细菌将胞内的药物或毒性物质排出胞外的蛋白转运系统，位于细菌细胞膜上，其存在与临床上细菌对多种抗生素耐药密切相关，而外排泵抑制剂的开发有望缓解临床上细菌多重耐药的问题。其中研究较为清楚的外排泵蛋白包括铜绿假单胞菌中MexB 和 MexY以及大肠杆菌中的 AcrB等1,2。铜绿假单胞菌是院内感染常见的革兰阴性机会致病菌。既往研究发现，外排泵抑制剂 (Efflux pump inhibitor，EPI) 吡啶并嘧啶衍生物 ABI-PP 可以抑制 MexB 和 AcrB，但不能抑制MexY，因MexY底物结合区域存在更具疏水性的色氨酸基团 (Trp)，影响其与ABI-PP的结合3。然而MexB(Phe178Trp) 突变体仍然能被ABI-PP结合并抑制，说明存在其他关键氨基酸影响底物结合。基于以上的发现，研究者们对外排泵 MexB 的空间结构进行了研究，找到了MexB 中与外排泵抑制剂结合的关键氨基酸，相关研究于2022年10月发表在Antimicrobial Agents and Chemotherapy杂志上。

  首先，作者通过冷冻电子显微镜技术解析了野生型 MexB的晶体结构，并重点关注外排泵抑制剂结合区域所涉及到的氨基酸残基(图1)。

  图1. 野生型MexB的底物(ABI-PP)结合位点。(a) MexB三聚体与ABI-PP 结合的晶体结构。MexB单体分别以绿色、蓝色和红色表示;ABI-PP以黄色空间模型表示。(b) ABI-PP结合位点的视图。近端和远端结合口袋分别以绿色和蓝色圆圈表示;MexB与ABI-PP(黄色模型)的结合界面以红色表示。(c)结合位点关键的氨基酸残基。

  MexB与ABI-PP结合的氨基酸残基均以绿色模型表示;ABI-PP 分子周围的氨基酸残基分为三个区域，即：上层(Ile277)、中层(Ala279 和 Val612)和下层(Val139 和 Val571)。图C中，Phe178表示多肽链中第178位氨基酸为Phe(苯丙氨酸)，依此类推。Ile 异亮氨酸、Ala丙氨酸、Val缬氨酸、Pro脯氨酸、Tyr 酪氨酸、Met 蛋氨酸。然后，作者将ABI-PP结合位点关键的MexB氨基酸残基进行单个色氨酸突变，突变通过设计特定引物进行PCR定点突变(一种常用的基因定点突变技术，通过设计含有非特异性配对碱基的引物，再通过PCR将突变位点引入产物中，具有突变回收率高、可在任何位点引入突变、操作简单等优点)并测序验证所获得，之后对外排泵的功能进行测试。作者发现，上部和中部区域的色氨酸突变会导致显著的空间位阻，使ABI-PP无法进入并结合，失去外排泵抑制剂的功能，而正常的外排泵功能使得细菌可将培养基中的抗生素药物泵出，表现为细菌正常的生长曲线(图2)。

  图2 .ABI-PP对上部和中部区域的色氨酸突变无抑制作用。(a)携带空载pMMB67HE的大肠杆菌MG1655ΔacrBΔtolC在红霉素3 μg/mL以及0、0.5、2、8 μg/mL的ABI-PP下的生长曲线。(b到e)分别是表达野生型MexB (b)、MexB(I277W) (c)、MexB(A279W) (d)和MexB (V612W) (e)的大肠杆菌MG1655ΔacrBΔtolC在同等条件下的生长曲线。

  PP即ABI-PP 抑制剂。1277W, A279W, V612W均为色氨酸突变株(W为色氨酸缩写)。以I277W为例，为277位氨基酸由I异亮氨酸突变为W色氨酸。由于监测微生物生长曲线最常用的方法为测定600nm波长下的光密度，即OD600吸光度，故本文将A600作为细菌生长监测指标。ΔacrB表示敲除acrB基因，ΔtolC表示敲除tolC基因。当色氨酸突变发生在下部区域时，Val139突变为Trp (色氨酸)，表现为ABI- PP无法与外排泵结合发挥抑制剂的作用，细菌表现为各ABI-PP浓度下的正常生长，仅Val571W表现为与野生型 MexB一致的ABI-PP浓度依赖性生长(图3)。

  图3.ABI-PP对下部区域色氨酸突变的抑制作用。(a)携带空载pMMB67HE的大肠杆菌MG1655ΔacrBΔtolC在红霉素3 μg/mL以及0、0.5、2、8μg/mL的ABI-PP下的生长曲线。(b到d)分别是表达野生型MexB (b)、MexB(V139W) (c) 和MexB(V571W) (d)的大肠杆菌MG1655ΔacrBΔtolC在同等条件下的生长曲线。

  作者发现MexB的突变体中均失去了与ABI-PP的结合能力，仅V571W除外。此外通过分子结构解析软件PyMOL(一个开放源码的分子三维结构显示软件)对突变体空间结构的计算分析，手动调整相邻氨基酸侧链的扭转角等。作者进一步对5种关键氨基酸突变体与ABI-PP的结合位点进行模拟。结果显示MexB突变体V139W、I277W、A279W和V612W的色氨酸基团，在空间上存在侧链填充，影响了ABI-PP的结合位点。相反，在V571W突变体中，由于色氨酸的空间排列，其定位不会干扰ABI-PP结合，从而与野生型表现一致(图4)。

  图4. MexB突变体结构的计算模拟。(a到e)MexB突变体I277W (a)、A279W (b)、V612W (c)、V139W (d)和V571W (e) 与ABI-PP抑制剂结合模型模拟图。

  ABI-PP以黄色棒状空间模型表示，突变的色氨酸以白色球形填充模型表示。

  该研究表明，外排泵的空间结构决定了外排泵抑制剂与其结合的特征，结合位点的不同位置、不同氨基酸突变都会影响结合位点空间特性，进而影响外排泵抑制剂EPI的结合，使其临床疗效发生改变。研究外排泵抑制剂EPI的耐药性或有助于预测其他多药外排泵的耐药，并由此开发新型的外排泵抑制剂。

  【参考文献】

  1.Murakami S, Nakashima R, Yamashita E, Yamaguchi A. 2002. Crystal structure of bacterial multidrug efflux transporter AcrB.Nature 419 (6907):587–593.

  2.Aires JR, Köhler T, Nikaido H, Plésiat P. 1999. Involvement of an active efflux system in the natural resistance ofPseudomonas aeruginosa to aminoglycosides. Antimicrob Agents Chemother 43(11):2624–2628.

  3.Nakashima R, Sakurai K, Yamasaki S, Hayashi K, Nagata C, Hoshino K, Onodera Y, Nishino K, Yamaguchi A. 2013. Structural basis for the inhibition of bacterial multidrug exporters. Nature500(7460):102–106.

  原文：

  Yamasaki, S., Koga, N., Zwama, M., Sakurai, K., Nakashima, R., Yamaguchi, A., & Nishino, K. 2022. Spatial Characteristics of the Efflux Pump MexB Determine Inhibitor Binding. Antimicrob Agents Chemother66(11), e0067222.

  链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9664856/