核心提示：下一代测序技术（NGS）的广泛应用有助于理解细菌基因组变异与表型多样性的关系。全种群基因组多样性的描述为衡量目标种群适应环境的遗传变化预测提供了一个机会。
生物和环境研究的一个主要挑战是理解基因型和表型之间复杂的联系，以及环境在其间发挥的作用。遗传多样性(一个物种内的遗传变异)通常与表型变异相对应。在一个基因多样化的种群中，应对不断变化的环境往往会发生一些变异。因而，通过研究种群在新/不适宜生长的环境中的遗传变化有助于了解遗传多样性。基于此，Uthayakumar Muthukumarasamy等人利用99株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P.ae)临床分离株描述了该菌的核心基因组的单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)，证明了核心基因组的高度保守性。
作者首先将99株P.ae的测序数据与2株参考菌株基因组数据(PA14和PAO1，NCBI)比对，得到直系同源序列(基因序列相似>90%)，再从这些同源序列中找出核心基因组(3814)，软核心基因组(1257)和附属基因组(5539)，并表征了这些基因组大小与基因组个体数目的关系(图1)。结果显示，泛基因组会随基因组数目增加而增大，且增大速率高于单基因，暗示了选择进化发生在泛基因组中(图1a)。但作者也表示，P.ae的泛基因组进化是中性的(中性进化论)，因为泛基因组和软单基因(只存在于2-5个分离株中)表现出接近平行进化的状态(图1b)。随后，作者利用这3814个核心基因构建了系统发育树(图2)。核心基因组包括P.ae的7个标准多位点序列类型(MLST)基因(aroE, trpE, guaA, nuoD, ppsA, acsA, mutL)，占P.ae平均基因组大小的61%以上，提供了克隆系的精细分辨率。可以从中观察到，这99株临床株中有44株与PA14系统群聚类，55株与PAO1系统群聚类;以及序列分型(Sequence type，ST)信息，主要有ST235、ST111和ST132。由此，显示出了系统发育的多样性。然后，作者对核心基因进行展开分析(3,629,979个核苷酸)，发现了共计159,609个SNPs，即SNP水平上的平均序列多样性为0.04，显示了核心基因的高度保守性。其中，7个基因：rpsS，rpmC，minE，acpP，lppL，PA14_07370和PA14_12560，在所有分离株上均未发现SNPs。然而，发现了49,722个系统类群特异性SNPs，其中27,911个只存在于PA14类群中，其余21,811个存在于PAO1类群分离株中。因此，作者认为，核心基因上的序列变异并不是随机的，而是同一类群的分离株具有相同的SNP谱模式(图3)。作者也从中找到了463个严格的系统类群相关性SNPs，能够实现PAO1和PA14两种类群的菌株区分。总的来说，作者从核心基因组中找到了75,765个系统群相关(发散性)SNPs，49,722个系统群特异性SNPs，与系统发育背景无关的34,122个SNPs。在这34122个SNPs中，有27590个SNPs为同义SNPs，6532个为非同义SNPs(图4)。为进一步确定核心基因的保守性，研究引入了非同义替换与同义替换之比(dN/dS)，比值>1表示基因受正选择，<1表示基因受纯化选择，=1表示基因中性进化。通过对核心基因进行两两比较，3,814个核心基因的平均成对dN/dS比值为0.14(图5)，仅有6个核心基因(bfrG、fptB、napA、PA14_11160、PA14_65950和PA14_69250)的dN/dS比值在1~2之间，也即P.ae的核心基因整体上正处于纯化选择阶段。因此，作者得出结论：P.ae的核心基因整体上正处于纯化选择阶段，由此证明了核心基因的高度保守性。
图1 基因组个体数目与P.ae泛基因组大小和核心基因组大小的关系。(A)泛基因组、核心基因组和单基因的基因数量与测序的基因组数量之间的函数关系;(B)泛基因组、核心基因、单基因、软单基因(基因仅存在于2-5%的分离株中)和附属基因的饱和模型。
图2 99株P.ae临床分离株的系统发育树。右上角的等角无根树表示分离株有两个克隆复合体。中点赋根圆树中粉色代表PAO1类群分离株，紫色代表PA14类群分离株。内环的数字表示菌株的STs，其中NF表示新的STs(在数据库中未找到的)。
图3 不同分离株中SNP的分类。有根系统发育树(左)反映了两个主要类群中的ST特异性信息。在右边，以PA14_00190的210、214、563和859的四个核苷酸位置为例，展示了不同种类的SNPs。在210位，SNP呈100%发散;在214位，有一个分离物特异性SNP，只存在于分离物CH2922中;在563位，PA14类群特异性SNP，不存在于PAO1类群;在859位，该SNP通常在临床分离株中被发现，独立于系统发育背景。
图4 P.ae核心基因组内的SNPs集合表征。在159,609个SNPs中，47.47%是发散型SNPs;31.15%是类群特异性的;21.38%在独立于系统发育背景的分离株中被鉴定出来(收敛性)。收敛性SNPs包括17.29%的同义突变和4.09%的非同义突变。
图5 3814个核心基因的dN/dS比值。平均成对dN/dS比值为0.14。
论文DOI：10.1093/gbe/evaa059
