核心提示：多重实时荧光定量PCR（qPCR）的检测目标数量因PCR设备可用的荧光通道数量而受到限制。厦门大学李庆阁团队探索了一种探针标记策略：多色组合探针编码（Multicolor Combinatorial Probe Coding, MCPC）,可以显著增加一个反应中实时PCR检测的靶标数目。

  高通量、简单、可靠和成本效益高的分子检测方法对于有效地利用大量的遗传信息来阐明疾病机制、确定治疗和诊断的潜在靶点、跟踪受试者生物体的身份或起源以及为个体患者制定个性化的治疗方案至关重要。其中，qPCR的方法因其能够实时监测扩增子的荧光强度变化避免了开盖污染;以及其定量结果的高重现性、准确性使之应用广泛。尽管如此，由于设备的荧光收集通道数目有限(≤5)，“单色单靶标”的探针标记策略使得检测目标数目低于5重，极大地限制了qPCR在多重检测和基因分型中的应用。改进的qPCR方法，通过荧光扫描检测最终产物，将单管可检测的目标数量扩展至6重。不过，这种改进仍距离高通量检测较远。基于此，厦门大学李庆阁团队提出了MCPC探针标记策略，其设计原理可以概括为：利用有限数量(n)不同颜色的荧光团来标记大量不同的探针，把这些标记的探针放在一个体系中，理论上可以实现2n-1个靶标数目中的一个的检测(图1)。相较于在探针/引物上修饰不同组合的荧光基团，基于MCPC的多重策略更切实际。然而，想要从一个qPCR反应体系中实现多种靶标的检测，如何避免引物二聚体是必须解决的问题。在这里，作者提出了一个Homo-Tag Assisted Non-Dimer (HAND)系统，系统用到2种引物：加尾引物(在特异结合的序列的5’端加上人为添加的标签序列)和Tag。其原理可以概述为：在PCR反应的前几个循环中，低浓度的加尾引物的特异序列结合到DNA模板上，扩增形成的初始扩增子的一端与标签序列一样，另一端与标签序列互补，高浓度的Tag结合到初始扩增子两端的标签序列上进行进一步的扩增。倘若加尾引物形成引物二聚体，此时引物二聚体两端存在互补的标签序列，会各自形成一个稳定的茎环结构，而该结构不能作为下一轮扩增的模板，从而抑制了引物二聚体的积累，大大减少了引物二聚体。作者将此方案应用于10种常见食源性致病菌的检测，结果显示了HAND系统的确提高了MCPC方法的分析灵敏度，与单重PCR灵敏度基本一致(表1和图2)，这一改进确保了MCPC在临床环境中的稳健性。

  表1 单管PCR反应体系中实现病原十重检测

  MCPC策略易于实施在检测设定检测组中的一个靶标的场景中，是否能够应用于一个反应体系中同时检测2个或者更多病原，作者也通过构建一个模型研究给出了答案：采用6对MCPC代码的探针，分别靶向5种常见的β地中海贫血突变基因分型和β-球蛋白的一段保守区域，再组合实现另外15种突变的检测(表2)。在这里，作者利用239例临床样本实现了13种基因型的分型(图4)，结果显示，三重检测的检测限为10 pg gDNA，这可与单重PCR进行媲美。不过，这里也表明qPCR周期结束时的信号强度在对相同颜色组合的基因型识别中起着关键作用。因此，作者在这里也作出说明：当考虑和优化信号强度时，MCPC可以用于多个候选基因的同时检测。

  总的来说，MCPC策略扩展了qPCR的检测通量，超过了设备的荧光通道数目。基于MCPC策略，拥有4、5或6个荧光通道的观测设备可以从15、31或63个不同的候选基因型中识别出可能的病原靶标。另外，在现有的MCPC策略中，将荧光强度设置为一个固定且均衡的参数。倘若荧光强度变化，编码策略将从“排列组合”晋升至“指数”编码，可以更大地扩展多重qPCR的检测通量。当然，如何区分这么多的编码模式确实是一项艰巨的任务，未来或许可以借助机器视觉等计算机算法完成。

  表2 21种可能的基因型及其MCPC编码。

  图1 基于MCPC策略的多重qPCR示意图。这里采用了四种常用的荧光基团标记探针，包括：FAM;HEX;ROX和Cy5，以及一个通用的淬灭基团DABCYL来进行论述。图中数字表示MCPC赋予每种荧光团的四位数代码，组合的荧光团代码也进行组合。

  图2 基于HAND系统和MCPC策略实现病原多重检测的qPCR代表性定量结果(金黄色葡萄球菌;霍乱弧菌;志贺氏菌和伤寒杆菌)。纯化的DNA模板从100 ng进行10倍浓度梯度稀释至100 fg，无菌水作为阴性对照。

  图3 基于MCPC策略的多重qPCR实现临床样本中13种不同β-球蛋白基因型分型