核心提示：高灵敏度的数字化核酸技术对传染病的防治具有重要意义。近期，湖南大学蒋健晖课题组报告了一项新的多重LAMP技术：采用蝎形探针（Scorpion-shaped probes, SPs）和荧光显微镜计数液滴同时定量多个靶标。这也是将SPs作为环引物实现实时两重LAMP定量病毒cDNAs，并发展至液滴数字化系统的首篇文章。
传染病是全球最严重的健康问题之一。HIV、COVID-19等流行病的持续蔓延，使得灵敏、快速和经济的核酸检测技术(Nucleic acid detection, NAD)成为临床的一大迫切需求。数字化NAD(dNAD)技术有望实现病原的高精度、高灵敏度和绝对定量检测。dNAD技术起源于依赖精密温控设备的数字PCR，现已经发展至与等温扩增方法结合，如滚环扩增(RCA)，重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导等温扩增(LAMP)。LAMP是一种反应温度要求低和用户友好的高效核酸扩增技术，一些基于LAMP的NAD试剂盒已被商业化。伴随微流控的发展，数字化LAMP(dLAMP)也得到开发并用于各种病原体的检测。然而，LAMP的特殊扩增方式使得想通过设计多色荧光引物方案实现多重检测的方案困难，这是由于引物的轻微修饰即可显著改变反应扩增效率。在实时多重LAMP技术中，已有荧光探针标记引物这种策略。例如：荧光素标记环引物(邻近的鸟嘌呤核苷酸淬灭);末端标记荧光基团和猝灭基团的双结构内部引物的DARQ探针。不过，这些策略目前还未应用于数字化技术，这归因于液滴数字化需要高度特异且结构稳定的探针，以保证其在众多平行乳化单元中一致且高效地反应。简单通用的探针设计方法完成的多重LAMP探针，其特异性和扩增效率一致性较好，但不同的靶标需要设计对应的探针，这将增加反应体系的共存组分，继而极大可能降低扩增效率。
基于此研究背景，湖南大学蒋健晖课题组开发了一种新的多重液滴dLAMP技术，利用靶标特异性的荧光激活蝎形探针(SPs)和荧光显微镜计数液滴实现病毒cDNAs的绝对定量(图1)。所设计的SPs，是通过简单地从环引物LB的3’端延伸形成一个固定通用的发夹结构，在发夹结构两端：一端标记BHQ2淬灭基团，一端标记特定颜色荧光报告基团。由于分子内折叠，蝎形探针结构稳定。SPs在初始完整状态荧光淬灭，背景荧光低。在LAMP反应过程中，SPs作用类似于靶标的扩增环引物，扩增使得SPs的发夹结构打开，因此激活了特定颜色的荧光信号。
作者首先利用SPs实现实时多重LAMP，验证了引物和SPs的特异性并获得HCV和HIV cDNAs的检测限，分别为5×10-18 M和7×10-18M(四次重复实验)，见图2。然后，基于液滴微流控发展多重dLAMP。在这里，作者首先利用600 copies/μL HCV和HIV cDNAs初步评估了所建立方法的定性定量能力，定量结果分别为551和555 copies/μL(图3)。随后，利用空白样本的4次重复检测中平均计数的三倍标准差，估计HCV和HIV cDNAs的检测限为4 copies，并在这里获得了方法的线性动态范围12~2400 copies/sample(~3.9 μL/sample)，见图4。再者，作者利用混合浓度的HCV和HIV cDNAs进行多重dLAMP，证明了方法的准确的多重定量能力(图5)。最后，作者也利用16例血浆样本验证了方法的临床适用性，其结果和qPCR检测值偏差：-20%~-2.5%(图6).
总的来说，作者开发的SPs是从LB 3’端延伸形成的，虽然在引物上进行两端标记会提高实验成本，但是，这个发夹结构是固定通用的，不需要跟随靶标或者引物进行优化，从而使得，反应扩增效率更一致和稳定，在数字系统中适用性也更强;开发的多重dLAMP技术为高灵敏度，高特异性地检测病毒或其它病原体的核酸提供了一个解决方案，能够实现快速诊断和预防疾病。不过，值得关注的是，该方法实现2重检测，已占用了3个荧光通道，仍然存在多重扩展能力有限的问题。
图1 A)利用荧光激活的SPs实现多重LAMP的反应原理。B)带有显微计数系统的多重dLAMP。
图2 A-D)HIV和HCV cDNAs引物及SPs的高特异性验证;E-F)HIV和HCV cDNAs引物及SPs的灵敏度表征。
图3 多重dLAMP检测HCV和HIV cDNAs。(A和B)HCV和HIV cDNAs在完成LAMP反应后所得的荧光图像。比例尺：200μm。(C)HCV和HIV阳性液滴的荧光强度分布。(D)HCV和HIV cDNAs的阳性液滴计数。
图4 (A和B)多重dLAMP定量不同浓度的HCV和HIV cDNAs所获得的荧光图像。比例尺：200μm。(C和D)HCV和HIV cDNAs的定量拷贝数与实际拷贝数之间的线性关系。误差棒代表四次重复实验的标准差。
图5多重dLAMP定量HCV和HIV cDNAs的混合样本。(A)120 copies/μL HCV和HIV cDNAs;(B)120 copies/μL HCV cDNAs和1200 copies/μL HIV cDNAs;(C)1200 copies/μL HCV和HIV cDNAs的荧光图片及其液滴计数。比例尺：1000 μm。
图6 临床血浆样本中HCV和HIV cDNAs qPCR和多重dLAMP定量值的比较。
原文doi：10.1039/d1sc00616a
