核心提示：基于病毒宏基因组数据耦合生物信息学分析，探讨实验室规模活性污泥反应器中同时追踪烈性和温和噬菌体的时间动态变化。
噬菌体(phages)是地球上丰富多样的微生物群落成员，分为烈性和温和噬菌体。通过非培养性分子技术，特别是宏基因组学，研究人员们对水生生态系统中噬菌体多样性、动力学和噬菌体-宿主相互作用有了更全面的了解。然而，目前的噬菌体研究主要集中在烈性噬菌体，对温和噬菌体了解有限。
生物废水处理(BWT)利用细菌群落的代谢去除污染物。噬菌体(VLPs)数量比细菌高10倍，浓度为每毫升10-8至10-10颗粒。研究表明，控制噬菌体活性可能影响BWT微生物群落和处理效果。溶原性感染可以改变宿主适应度，而裂性感染抑制宿主复制。研究推测溶原-裂解开关可能会影响BWT中的微生物群落，但这种效应的程度和驱动开关的原因尚不清楚。该研究对实验室级活性污泥系统中裂性和温和噬菌体的时间动态进行探究分析。研究发现丝状污泥膨胀问题导致活性污泥微生物群落组成和性能发生显著变化。通过宏基因组测序和生物信息学分析，研究人员揭示了噬菌体动力学，尤其是温和噬菌体溶原-裂解转化规模。这项研究对于理解复杂BWT生态系统中噬菌体-宿主动态具有重要意义。
图1. 非膨胀阶段和膨胀阶段细菌群落的差异
(a) 细菌群落的分类学概况。左图为基于UniFrac距离的UPGMA聚类树状图，右图为每个样本在门水平上的相对丰度。(b) PCoA比较非膨胀污泥和膨胀污泥群落组成的差异。(c) LDA比较非膨胀和膨胀污泥样品在门到属水平上的细菌丰度差异(从外圈到内圈;LDA评分阈值>3.5;只显示了明确分类的分类群)。绿色和橙色分别代表在非膨胀污泥样品和膨胀污泥样品中存在显著差异的类群丰度。从最外层到最内层的字母依次代表门、纲、目、科和属。
首先，该研究使用活性污泥和病毒宏基因组数据进行耦合的生物信息学分析，探索了实验室规模的活性污泥反应器中游离烈性噬菌体和温和噬菌体的时间动态。在重建的细菌基因组中识别出的嵌合片段广泛分布在61.7%的最大成簇基因组(MAGs)中。即使使用更严格的预测，嵌合比例仍约为60%，而具有高误报风险的宽松预测可以超过90%。这些结果表明，在活性污泥微生物群落中嵌合体的普遍存在性。
由于游离噬菌体颗粒在处理出流中不断被冲走，而活性污泥过程中的嵌合体和宿主被保留在系统中，嵌合体可能在活性污泥过程中保护噬菌体免受衰减。此外，携带嵌合体可能改善活性污泥微生物群落中宿主的适应性和竞争力。在被众多噬菌体(这里是每毫升3.2 - 4.7×10-9颗粒)包围的情况下，嵌合化可能是活性污泥细菌抵抗感染的一种自然途径(超感染免疫)。这将使嵌合体，特别是那些具有多个不同嵌合体，通过裂解易受感染的竞争对手获得竞争优势。然而，由于基因组分辨率宏基因组学的限制，嵌合体的比例可能被高估。尽管MetaWRAP通过单拷贝基因数改进了基因簇预测，但得到的基因簇不能代表群落中单个个体甚至单个菌株的基因组。因此，在污泥微生物群落中，可能存在几个与嵌合体在系统学上接近的非嵌合体，它们可能是烈性感染的良好宿主，并有助于活性污泥微生物群落中游离噬菌体颗粒的大量产生。
图2. 非膨胀和膨胀阶段病毒群落的差异。(a) PCoA比较了非膨胀污泥和膨胀污泥之间游离病毒群落组成的差异。(b)细菌和游离病毒群落的病毒分析(该病毒平方和M2 = 0.257，r = 0.86，P = 0.001)。(c) Bar图显示了在非膨胀(N1-N7)和膨胀(B1-B5)阶段的门水平上的病毒宿主组成。(d)热图显示了宿主和相应的游离病毒在家族水平上的相对丰度。
在反应器运行过程中，噬菌体在活性污泥中是不活跃的。由于活性污泥系统中的微生物密度高于自然水生态系统，根据"依附在胜利者"的预测，嵌合体在密集的社群中更为有利。然而，不能排除不活跃嵌合体主要是由于基因组重排和逐渐衰减导致失去了病毒颗粒产生所需的基因的密码嵌合体。此外，在反应器中持续低丰度的活性嵌合体提示，反应器中的噬菌体群落主要由烈性噬菌体而不是温和噬菌体组成。在较短的停留时间可能导致污泥系统中噬菌体的迅速周转，这可能促进具有丰富宿主或较大裂解大小的快速繁殖能力的烈性噬菌体的富集。尽管对整个游离噬菌体群落的贡献有限，温和噬菌体的活性可能在调节以某些宿主细菌为目标的游离噬菌体的丰度方面发挥重要作用。
图3. 温带噬菌体群落在非膨胀阶段和膨胀阶段的差异。(a)非膨胀期和膨胀期PrGs的潜在宿主分布。(b)PrGs和整合酶的相对丰度。(c) PCoA比较了非膨胀污泥和膨胀污泥之间PrG群落组成的差异。
根据研究的数据，污泥性质，特别是与微生物密度(MLSS和MLVSS)相关的性质，是影响烈性噬菌体和温和噬菌体群落组成的关键操作参数(图4a)。研究还发现，针对主导污泥细菌的噬菌体主导了噬菌体群落。因此，反应器中的病毒感染似乎是密度依赖的，即"更多微生物，更多病毒"。活跃温和噬菌体的丰度也表现出密度依赖动态。活跃嵌合体和病毒基因组编码整合酶基因的丰度与MLSS显著且正相关(图4b)。具体而言，一些宿主的丰度与相应的活跃温和噬菌体之间存在正相关关系。因此，在活性污泥系统中，活跃温和噬菌体似乎更倾向于在生物量增加时进行裂解复制，这暗示着微生物密度是溶原-裂解切换的重要调节因子。在污泥蓬松阶段观察到病毒和活跃温和噬菌体的丰度较低。这可能与宿主的生理状态有关，它对病毒感染和增殖至关重要，因为它会影响噬菌体吸附、复制、裂解活性和裂解-溶原切换。在本研究中，低污泥负荷导致活性污泥中微生物之间资源的激烈竞争，特别是在蓬松阶段。这压缩了许多其他细菌的生态位，可能恶化它们的生理状态，从而降低病毒产量。
图4. 环境因素与噬菌体动力学之间的相关性。(a)环境驱动因素与Mantel测试结果的相关矩阵。上面的三角形表示环境因素的两两比较，用颜色梯度表示斯皮尔曼的相关系数。采用部分(地理距离校正)Mantel检验，FVG组成和PrG组成与每个环境因素相关。线色表示统计意义，线宽表示对应距离相关性的Mantel的r统计量。(b)MLSS与PrG、FVG和整合酶丰度之间的线性回归模型。
大量嵌合体诱导随之而来的大量功能菌细胞的突然裂解被认为是处理过程失效的潜在触发机制。基于纯培养的实验已经证明，在废水处理过程中，各种环境应激因子(如pH、温度和有机碳)可以诱导氨氧化细菌中的嵌合体诱导。在本研究中，在反应器运行过程中，细菌群落波动剧烈，伴随着纤维性膨胀和氮去除能力的下降，这可能导致污泥系统的物化环境发生显著变化。然而，宏基因组分析显示，在反应器中并未发生可观察的嵌合体诱导事件。相比之下，实际废水处理厂的环境条件可能比合成废水反应器更加复杂，需要进一步研究。
参考文献：Microbial density-dependent viral dynamics and low activity of temperate
phages in the activated sludge process. https://doi.org/10.1016/j.watres.2023.119709
