核心提示：越来越多的证据表明，肠道微生物群作为肠脑轴的关键介质，在人体健康中起着重要作用。肠道微生物谱的改变与增加精神疾病的脆弱性有关，如自闭症、抑郁症和精神分裂症。然而，这种关联的细胞和分子机制仍然未知。

  ——摘要——

  越来越多的证据表明，肠道微生物群作为肠脑轴的关键介质，在人体健康中起着重要作用。肠道微生物谱的改变与增加精神疾病的脆弱性有关，如自闭症、抑郁症和精神分裂症。然而，这种关联的细胞和分子机制仍然未知。在这里，我们用抗生素修饰了新生小鼠的肠道微生物组，发现肠道微生物改变通过减少成人神经发生和突触传递的长期增强以及改变海马体中的基因表达谱而诱导行为障碍。用正常的肠道菌群重建对生态失调小鼠的成年神经发生和行为缺陷产生了治疗作用。此外，结果表明，循环代谢物的变化介导了肠道生态失调对海马可塑性和行为结果的影响。升高血清4-甲基苯酚(一种由肠道细菌产生的小芳香代谢物)被发现诱导自闭症谱系障碍(ASD)样行为障碍和海马功能障碍。发现共同表明，早期肠道生态失调及其相关的代谢物变化会导致海马功能障碍和行为障碍，因此突出了潜在的微生物组介导的治疗精神疾病的疗法。

  ——实验框架——

  ——主要结果——

  1、抗生素治疗破坏肠道微生物组成

  通过用抗生素氨苄西林(Amp)或万古霉素(Van)治疗新生小鼠四周(P1-P28)创建生态失调小鼠模型。在最终抗生素治疗后两周，收集小鼠粪便进行16S rDNA高通量测序。新生儿抗生素暴露诱导了肠道微生物组成的剧烈变化。暴露于抗生素的小鼠表现出较低的α多样性(物种多样性)，如香农和辛普森指数图2(a，b)。基于布雷-柯蒂斯距离的主坐标分析(PCoA)显示，载体处理组(Con)和抗生素处理组(Amp和Van)之间的细菌结构存在明显差异，(图2c)。在门水平上，抗生素处理的小鼠具有厚壁菌减少和蛋白杆菌增加的特征(图2d)。在属水平上观察到载体处理和抗生素处理的小鼠的更好分离。在抗生素干预后，35个主导属的丰度显着变化(图2e)。其中，一些细菌与神经和精神疾病有关(图S1)。例如，据报道，在焦虑和抑郁患者中，阿利斯提普斯，巨单胞菌和副拟杆菌升高;发现阿利斯提普斯和布氏肌瘤与认知能力呈负相关；脱硫弧菌，副杆菌和拟杆菌在自闭症患者和自闭症模型小鼠中显着增加。

  2、生命早期的肠道生态失调会引起焦虑并损害空间记忆

  行为测试数据表明，与空白对照组相比，抗生素处理小鼠显着减少开放场试验(OFT)中在中心的行进距离和时间(图3a)，表明运动活动减少和焦虑样行为增加。高架十字迷宫(EPM)测试显示，抗生素治疗的小鼠在开放手臂中花费时间更少，且减少开放手臂条目的数量(图3b)。莫里斯水迷宫(MWM)测试评估空间学习和记忆。与载体处理的对照组相比，Amp处理小鼠从训练第3天到第6天的逃生潜伏期更长，且第6天的Van处理小鼠中发现类似表现(图3c)。探针试验表明，抗生素处理小鼠显着减少目标象限中的行进时间和穿过平台区域的次数，显示出明显的空间记忆障碍(图3c)。三室社会测试中，Amp治疗小鼠表现出社会新颖性的损害，而社交能正常。Van治疗小鼠表现出社交能力下降和社交新颖性的缺陷(图3d)。综上，早期肠道微生物群的破坏诱发了焦虑样行为，并损害了社会新奇性和空间记忆。通过使用Spearman分析行为结果与特定细菌共变相关性，八个细菌属的丰度与几个行为指标显着相关(图3e)。特定细菌属和行为结果之间的关联进一步证明特定细菌可能有助于调节行为。

  3、肠道微生物群的破坏损害突触可塑性和成人神经发生

  分析早期生态失调对树突状脊柱形态发生的影响。与对照组相比，抗生素处理小鼠在背海马的齿状回(DG)中表现出较少的根尖树突状棘，具有成熟的形态(图4a)和腹侧海马的CA1(图S2A)，表明健康的早期生命肠道微生物群促进脊柱成熟。使用针对5-乙炔基-2'-脱氧尿苷(EdU)和双皮质素(DCX)的抗体标记成年海马祖细胞的增殖和神经元分化。抗生素干预后，EdU、DCX或双标记DCX-EdU阳性的细胞数量显着减少，小鼠的成年神经发生受损(图4b，S2B)。

  评估肠道微生物群的破坏是对突触传递的长期增强(LTP)的影响。记录现场兴奋性突触后电位(fEPSP)。空白治疗组中应用短暂的高频刺激诱导fEPSP的LTP，在抗生素治疗小鼠中仅观察到fEPSP的瞬时增加(图4c)，表明LTP受损。

  4、肠道微生物群的破坏改变了海马体中的基因表达

  抗生素治疗小鼠行为结果差异的分子决定因素，对海马体进行转录组学分析。发现与野生型对照相比Amp处理和Van处理小鼠中149个基因和34个基因的表达水平显着变化图(5a,b)。共有的11个常见差异基因主要编码与免疫和炎症相关的蛋白质，包括免疫球蛋白重恒定γ2B基因(Ighg2b)，脂质链蛋白-2(Lcn2)和S100钙结合蛋白A8和A9编码基因(S100a8，S100a9)(图S3A)。LCN2和富含亮氨酸的α2-糖蛋白(LRG1)在海马神经元中的表达显着增加(图5c,S3B)。LCN2在海马神经元中的过表达会降低脊柱密度并抑制脊柱成熟。海马LRG1过表达已被证明会诱导突触功能障碍和降低兴奋性突触后电位，从而损害记忆。

  功能富集分析表明，大多数上调基因属于免疫反应和过程以及凋亡过程的广泛类别。发现肠道生态失调增加了裂解的半胱天冬酶-3阳性神经元的数量(图S3D)并诱导海马体中的神经元丢失(图S3E)。转录数据显示，肠道微生物群的破坏增加了病原体识别基因(Cd14，Tlr6)，免疫球蛋白基因(Ighg2b,Igha，炎症反应基因(Ccl12,S100a8和S100a9)和白细胞招募基因(Sele,Icam1和Cd24a)的表达。还发现，在抗生素治疗小鼠的海马体中，CD3E-，CD11b-和CD45阳性细胞的数量显着增加(图5d)。这一结果与之前的报道一致，即肠道生态失调可能会刺激免疫反应，促进免疫细胞的迁移和渗透到大脑中。观察到，在野生型小鼠的海马DG中进行社会行为测试后，包括Egr1，FosB，Npas4和cFos)的直接早期基因()(IEG)的蛋白质表达受到高度诱导，而抗生素处理导致IEG的蛋白质表达受损(图5e, 3B, 4)。IEG主要编码早期反应转录因子，据报道这些转录因子是由广泛的刺激诱导的，例如新物体和社会压力，并且它们与许多神经元功能有关，例如突触可塑性，学习，记忆和空间探索。

  5、用正常的肠道微生物群重建可以挽救抗生素治疗小鼠的行为缺陷

  在证明肠道生态失调诱导的行为缺陷并改变海马体中的基因表达谱后，研究用正常肠道菌群重建是否对肠道生态失调小鼠产生治疗效果。通过移植来自健康供体的肠道微生物群(相同年龄的SPF小鼠)，抗生素治疗小鼠的行为缺陷显着改善图6(a，d)。粪便微生物群移植(FMT)处理的小鼠没有表现出焦虑样行为，如OFT中心区域花费的时间(图6a)和EPM测试中开放臂条目的数量(图6b)所示。FMT显著提高Amp治疗小鼠的空间学习和记忆能力以及对社会新颖性的偏好，如MWM测试中目标象限的时间行进和跨平台的次数显着增加(图6c)，并延长了三室社会测试中的接触平均持续时间(图6d)所示。正常微生物群移植的Van处理的小鼠恢复了MWM测试(图6c)和三室社会测试(图6d, S5A)中的水平。

  FMT不仅挽救行为缺陷，还恢复了抗生素治疗小鼠的成年神经发生(图6e，S5B, S6)和海马LTP(图7a)。结果还表明，正常微生物群重构可挽救IEG，LRG1和LCN2的表达(图7b)。同时，FMT后抗生素处理的小鼠中病原体识别基因(Tlr6)、白细胞募集基因(Icam1和Lsp1)和促炎基因(Ccl12)的海马mRNA水平也得以恢复(图S5C)。综上所述，早期微生物组的破坏对行为障碍、海马体的转录变化和成人神经发生障碍起着因果作用，凸显了肠道微生物群在调节大脑发育和行为中的重要性。

  6、肠道微生物群的改变诱导血清代谢物的变化

  基于UHPLC-MS / MS的非靶向代谢组学方法来确定血清代谢组是否受到肠道微生物群破坏的影响。阳性和阴性离子模式下血清中检测到946种已知代谢物。与载体处理的对照组相比，Amp处理小鼠血清中139种代谢物显着变化(VIP>1和P值<0.05和折叠变化>2)，Van处理小鼠中有60种代谢物显着变化，且两组共享27种代谢物(图8a, S7A)。

  在功能上，差异代谢物主要参与脂质，苯类化合物，氨基酸，碳水化合物和有机酸的代谢(图8b,S7B)。脂质代谢物主要富集在两类，其中许多对血脑屏障具有高度渗透性，且可能对神经炎症和神经功能有影响，例如类花生酸衍生物，甘油磷脂。

  除脂质代谢物外，几种分子也可能与神经功能障碍有关(图8b)。α-甲基多巴会抑制小鼠的自发运动活动;高水平的脯氨酸降低了肌酸激酶活性并诱导了大鼠大脑中的氧化应激;黄体酮是一种性腺类固醇激素，通过其全身抗炎和BDNF调节作用发挥神经保护/调节作用。几种显着转移的代谢物来自肠道微生物群(图8b)，包括4-甲基苯酚，雌马酚，5-羟基吲哚-3-乙酸和马尿酸。代谢产物4-甲基苯酚，一种有毒的芳香族化合物，由肠道中产生的厌氧细菌属于椰油菌科和发酵酪氨酸或甲苯的梭状芽胞杆菌科。4-甲基苯酚已被提议作为自闭症的可能尿液生物标志物，并且在母体免疫激活(MIA)治疗小鼠的后代血清中检测到高水平。结果表明，早期肠道微生物群的改变足以引起血清代谢组的显着变化，代谢物的变化可能导致大脑发育和行为异常。

  7、血清代谢物4-甲基苯酚损害海马可塑性和社会行为

  选择代谢物4-甲基苯酚进行进一步验证。首先确定是否对原代海马神经元具有相同的作用。实时RT-PCR，4-甲基苯酚暴露增强有丝分裂相关基因(Mfn1和Opa1)和促凋亡基因半胱天冬酶-3的表达，降低细胞周期相关基因(Cdk2，Cdk4和细胞周期蛋白D1)和抗凋亡基因Bcl2(图9a)。4-甲基苯酚暴露显著降低了cFos、Egr1、Npas4和NMDAR1的表达，增强LCn2和S100a9的表达。蛋白质印迹分析显示，4-甲基苯酚处理后，几种促炎和促凋亡蛋白也过表达，如S100a8，S100a9，裂解半胱天冬酶-3(图9b)。

  研究增加血清4-甲基苯酚是否足以引起幼稚小鼠的任何行为异常。小鼠用4-甲基苯酚或载体治疗。与载体处理的对照组相比，4-甲基苯酚处理小鼠增加了OFT中的运动活性(图9c)，减少开放臂进入的数量和在EPM测试的开放臂中行进的持续时间(图9d)。4-甲基苯酚处理的小鼠表现出社会障碍，如降低社交性指数和社会新颖性指数图9(e, f)。4-甲基苯酚处理显著降低社会行为试验诱导的IEG表达的上调(图9g,S8A)，增加海马细胞中LCN2、LRG1、S100a8、S100a9和裂解半胱天冬酶3的表达图9(h, i)。还观察到，随着炎症和凋亡信号的增强，海马CA1和DG神经元丢失(图S8B-S8C)。以上数据证明细菌代谢物4-甲基苯酚通过降低海马可塑性和促进神经元的炎症和凋亡而诱导的行为损害。

  综上所述，血清中4-甲基苯酚水平升高通过增加焦虑和减少社会活动而特异性地引起ASD样行为障碍，这表明早期生活中的代谢组学变化有助于精神疾病的发病和发展。鉴于如此多的血清代谢物在肠道菌群失调后显着变化，更复杂的行为变化可以通过这些代谢物的组合来调节。

  8、宿主血清代谢物与肠道微生物群的关联

  为了研究改变的肠道微生物群和受干扰的血清代谢物之间的潜在依赖性，评估了差异代谢物与肠道细菌丰度之间的Spearman相关系数，并以热图的形式显示(图10)。结果表明，许多神经活性代谢物的水平与主导微生物属的相对丰度显著相关。代谢物4-甲基苯酚与梭菌呈显著正相关，这一结果与以往关于产生4-甲基苯酚的细菌主要属于梭状芽胞杆菌簇的报道一致。促炎代谢产物蛋白(前列腺素B2、血栓素B1和B2)和类二十烷酸衍生物((±)8(9)-EET和12(S)-HETE)与乳球菌、unidentified_丁芷科和丁酰基莫那呈显著正相关，代谢产物溶血磷脂酰丝氨酸(LPS)、二十碳五烯酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸呈显著正相关。相反，具有神经保护作用的代谢物(R)-equol与机会性病原体阿利斯蒂斯普斯和去硫磷在抗生素治疗小鼠中富集呈显着负相关。总的来说，这些发现表明，特定的肠道细菌可能对宿主代谢的调节有显着贡献，这与以前的报告非常一致，即肠道微生物群参与调节多种宿主代谢途径，在人类健康和疾病中起着重要作用。

  ——结论与展望——

  结果表明，由两种不同的抗生素诱导的早期肠道生态失调导致小鼠类似的海马功能障碍和行为损伤，并表明血清代谢物的变化可能介导这种作用。然而，其潜在机制可能存在差异。事实上，两组抗生素干预小鼠之间肠道微生物群的组成和结构以及海马转录变化存在差异。

  表明产后早期生活代表了肠道生态失调通过重塑血清代谢组学而损害神经发育的关键时期。研究结果强调了微生物代谢物在早期大脑发育和行为中的重要作用，并强调了微生物组介导的治疗神经发育障碍的潜在疗法。然而，需要进一步的研究来揭示肠脑通讯的确切机制，并研究特定细菌在大脑发育中的作用。

  题目：Gut dysbiosis impairs hippocampal plasticity and behaviors by remodeling serum metabolome

  发表杂志：Gut Microbes

  发表年月：2022年7月24日

  第一作者：Guoqiang Liu

  通讯作者：Youming Lu

  第一单位：华中科技大学基础医学院和同济医学院

  影响因子：13.437

  DOI： doi.org/10.1080/19490976.2022.2104089