PMA-qPCR方法对发酵乳中活乳酸菌进行选择性定量
原创 发布时间:2024-02-06 浏览次数: 123 来源: 凌纪云

核心提示:该研究通过将平板计数法、qPCR和共聚焦激光扫描显微镜的结果进行比较,使该方法的准确性得到了验证。


  发酵是一种古老的食品加工技术,在世界范围内已经使用了数千年。发酵乳是一种典型的发酵食品,它是用乳酸菌(LAB)发酵牛奶生产的,乳酸菌株通常与自然界分离,可以在胃肠道中存活。发酵乳因其独特的口感、良好的风味和丰富的营养成分而深受消费者欢迎。发酵牛奶是一种受欢迎的食品,通过用乳酸菌(LAB)发酵牛奶制成,具有独特的味道、风味和营养成分。而发酵牛奶的质量取决于活的乳酸菌的数量,在整个保质期内,发酵乳中的活菌数不应低于一定数量。而现在常用的测定发酵乳中LAB物种可行数量的传统培育方法既费时又不准确,同时流式细胞术、qPCR、16S rRNA 基因测序和宏基因组分析等非培养方法已用于细菌检测,但这些方法的检测成本通常较高,很难得到大范围的应用。而单叠丙啶(PMA)和qPCR的组合的方法具有检测时间短、准确度较高和成本低等优点,且该方法也已经大量应用于量化各种基质中的活细菌。

  这项研究使用了PMA-qPCR方法来检测发酵牛奶中每种LAB物种的活菌数量。选择 phES 基因来为每个 LAB 物种设计特定的引物和探针,并构建了一条用于绝对定量的标准曲线。而PMA-qPCR方法可以在3小时内快速定性和定量测定发酵乳中每种实验室物种的活菌数量。

  本研究使用 PMA-qPCR 方法检测发酵乳中每种 LAB 物种的活菌数量。分析了五种实验室中的phES基因和16S rRNA基因序列的相似性,以设计特定的引物和探针。phES 基因被克隆到 pUc19 载体中,用于构造绝对量化的标准曲线。为每种实验室物种构建了标准定量曲线,其连续稀释度介于 1011 到 106 CFU/mL 之间,R2 > 0.99。pma-qPCR检测到发酵乳中的活细菌数量,明显低于qPCR,这表明PMA抑制了死细胞DNA的扩增。进行了细菌染色和板块计数实验以证实结果。拟议的pma-qPCR方法可以在3小时内快速定性和定量测定发酵乳中每种实验室物种的活菌数量。

  本研究成功地使用PMA-qPCR方法在3小时内检测发酵牛奶中每种LAB物种的活菌数量。phes基因之所以被选为鉴定实验室物种的目标基因,是因为与16S rRNA基因相比,其序列相似度较低,允许为每个物种设计特定的引物和探针。使用介于 1011 到 106 CFU/mL 之间的连续稀释,为每种 LAB 物种构造了标准的定量曲线,其中 R2 > 0.99。PMA-qPCR检测到的发酵乳中活菌的数量明显低于qPCR的活菌数量,这表明PMA抑制了死细胞DNA的扩增。细菌染色和板数实验证实了这一点。拟议的 PMA-qPCR 方法可以快速定性和定量测定发酵乳中每种 LAB 物种的活菌数量。

  该研究通过将平板计数法、qPCR和共聚焦激光扫描显微镜的结果进行比较,使该方法的准确性得到了验证。但是,这些比较方法本身的准确性和可靠性也存在局限性,只能一定程度上来证明。且本研究的PMA-qPCR方法仅针对发酵牛奶进行了测试,未探讨其对其他基质或食品的适用性,及不同的加工条件或发酵变化对PMA-qPCR方法准确性的潜在影响。

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