核心提示：人类肠道菌群是一个复杂的生态系统，它庇护着几个生命王国的成员，包括动物(寄生虫)、真菌、原生生物、原细菌和细菌，以及除了人类宿主以外的感染所有这些生命的病毒。这些生命之间复杂的相互作用在人类的健康和疾病中起着重要作用。

  人类肠道菌群是一个复杂的生态系统，它庇护着几个生命王国的成员，包括动物(寄生虫)、真菌、原生生物、原细菌和细菌，以及除了人类宿主以外的感染所有这些生命的病毒。这些生命之间复杂的相互作用在人类的健康和疾病中起着重要作用。

  肠道病毒——肠道中所有病毒的集合——以噬菌体为主，这种噬菌体在出生时几乎没有，但在出生后的最初几周内迅速出现。对8名婴儿的304份粪便样本进行了病毒组和16/18S分析，超过85%的噬菌体reads对应305个接近完整的基因组，其中大部分(70.5%)是婴儿特异性的，包括两个crAs噬菌体，而7.8%的噬菌体存在于至少50%的婴儿中。

  细菌宿主可以预测80%的噬菌体，主要感染厚壁菌门。我们发现超过40%的噬菌体与它们预测的宿主细菌之间存在很强的时间相关性，并且观察到具有温和生活方式的噬菌体的比例在下降，进一步表明噬菌体是由早期的定殖细菌诱导而来的。绝大多数(>86%)鉴定的真核病毒，已知可引起肠胃炎，发生时没有临床症状，在进入日托中心后感染率增加。平均每个婴儿可鉴定出112个不同的指环病毒基因组contigs，其中一些是在出生后1年脱落的。

  鉴定出的植物病毒反映了婴儿的饮食。最后，真菌和寄生虫的零星鉴定反驳了研究人群中存在这种稳定群落的观点。总的来说，关于婴儿肠道菌群的不同成员，这项工作提供了一个非常高的时间分辨率，特别是病毒群，如何随着时间在健康婴儿的肠道中发展，并可能为进一步研究婴儿肠道菌群扰动的影响提供有价值的基线知识。

  婴儿出生时的肠道基本上是无菌的，原核生物逐步在肠道中定殖，在2岁时可以达到稳定的成人样成分。这一主要定殖过程的紊乱可造成终身的健康影响，并与多种疾病相关，如炎症性肠病(IBD)，哮喘和I型糖尿病(T1D)。评估肠道菌群(即肠道病毒群)在健康和疾病中的作用还比较落后，但与IBD、T1D和结直肠癌等人类疾病的联系越来越多。

  通过对肠道菌群(即肠道病毒群)的共同基因组的分析中发现，从组成上看，成人和婴儿肠道病毒以噬菌体为主，但其中大多数仍未查明，因此被称为“病毒暗物质”，这使得病毒体分析复杂化。本研究中，从8个健康的比利时婴儿中选取了304份粪便样本，对纯化的病毒颗粒进行鸟枪测序。在所有经过质量筛选的reads中，83%的reads被发现是病毒起源，原核病毒是婴儿肠道病毒组中最主要的成员，只有一小部分是细菌或人类起源(图1 A)。

  在BaBel婴儿肠道(BIG)噬菌体中，只有34%的BIG噬菌体可以确定属于病毒家族。长尾噬菌体科家族是最普遍的噬菌体家族，但就比例丰度而言，微病毒科成员占主导地位(图1B)。噬菌体在婴儿肠道病毒组中占优势，真核病毒组主要属于与疾病相关的哺乳动物感染病毒(DaMiVs) (图1C)。环状单链DNA (ssDNA)病毒家族(如Anellovirusdae)数量较少但非常普遍，与疾病没有任何因果关系。此外，还发现了几种植物和真菌感染病毒(PIVs和FIVs)。

  婴儿肠道显示出惊人的独特性，超过70%的BIG噬菌体是婴儿特异性的。值得注意的是，也有8%的BIG contigs出现在一半或更多的婴儿身上(图1D)，这表明婴儿的“肠道核心噬菌体”是相当保守的。

  微生物在婴儿肠道的定殖是发生在出生前、出生中还是出生后，这仍然是一个谜，并且有很大的争议。对于BIG噬菌体，我们观察到在生命的最初几周内，contig丰富度迅速增加。虽然这并不意味着出生时无菌，结合这种现象以及从出生后最初几天和几周的样本中获得的少量病毒reads，表明肠道噬菌体的最初获得发生在出生后不久。

  在这种快速增长之后，我们发现在第一年的后半段(大约在第200天达到峰值)，丰富度缓慢增长，之后又略有下降，在第一年年底稳定下来(图1E)。产生这种现象的原因可能是在婴儿肠道中达到一个临界点，噬菌体不再被允许进一步定殖。

  大多数噬菌体与单一肠道菌群成熟阶段有关。BIG菌组的成熟经过三个不同的、保守的生态系统发展阶段，称为肠道菌群成熟阶段(GMMSs)。这些连续的GMMS被称为GMMS A、B和C，反映了婴儿之间遵循保守模式的强烈的时间逻辑性。观察到这些GMMS中的细菌属优势分别从埃希氏菌转移到双歧杆菌和拟杆菌。令人惊讶的是，62%的BIG噬菌体与这些阶段中的一个严格相关，反映了一种特定的细菌组成。(图1F)。

  接下来研究了BIG噬菌体的生活方式。绝大多数(76%)的BIG噬菌体被预测有可能具有温和的生活方式(图1G)。温和噬菌体的比例在第一年末有明显下降趋势，且第一个和最后一个年龄区间之间有显著差异(图1H)。这一观察结果与最初的噬菌体是由早期的定殖细菌诱导产生的假设是一致的。温和噬菌体的比例在第一年保持较高，以及噬菌体与特定细菌GMMS的相关性，表明在第一年，虽然定殖还没有完成，但新定殖的细菌会不断诱导噬菌体的产生。

  图1：婴儿肠道病毒体的成员。(A)每个分类类别的质量过滤后的reads分布概况。(B)根据读数(左)和读数对BIG噬菌体的分类学分类叠连群(右)。(C)真核病毒经高质量筛选的病毒组序列的分类学分布综述(C，左上)。每个类别显示了所有真核病毒的分类：感染人类的病毒，小环形单链DNA病毒，PIVs和FIVs。(D)不同的婴儿共享BIG噬菌体。 (E) BIG噬菌体的丰富程度随时间的变化。(F)来自婴儿S003的BIG噬菌体的例子，对特定的GMMS有明显的偏好。GMMS A(左)，GMMS B(中)和GMMS C(右)。

  与观察到的细菌种群定殖阶段相比，同疾病相关的哺乳动物感染病毒(DaMiVs)表现出短暂的急性峰值，通常在很长一段时间内无法检测到。一般来说，在出生后的头几个月观察到的DaMiVs数量较低，随后几个月增加。有趣的是，这些早期DaMiV感染都与临床症状无关。尽管属于DaMiV的病毒是已知的肠胃炎病原体，但在开始感染后7 d内，BaBel婴儿肠道中86%的病毒感染没有引起呕吐或腹泻等肠道症状(图2A)。

  为了调查是什么触发了第一年下半年观察到的感染增加，比较了饮食改变(停止母乳喂养、开始配方奶喂养或固体食物)或开始日托等事件前后累积的感染数量。只有进入日托所与获得性DaMiVs的增加显著相关(图2B)。此外，在对每个事件的时间进行归一化处理后，只有在婴儿进入日托中心前后才观察到感染率(即每天感染的数量)的显著差异(图2C)。

  图2：DaMiV感染在健康婴儿肠道内积累的概述。(A)检测到的DaMiVs(在物种水平上)特有的感染数量随时间的积累。黑色十字表示感染开始后7天内检测到肠道症状(腹泻或呕吐)的感染。(B)箱线图显示了相关特定事件(开始日托、母乳、配方奶、水果、蔬菜、前半年)开始前后的累计感染数量。入托前后累计感染数差异有统计学意义。(C)每天的累计感染数量(即感染率)。

  到目前为止，最多样的真核病毒家族是指环病毒科，跨越了三个已知的与人类相关的属：Alphatorquevirus, Betatorquevirus, Gammatorquevirus (图3A)。这个病毒家族很令人费解，因为它已经在人类的血液、唾液和粪便中被检测到;然而，尚未确定这些病毒在细胞培养物中的复制和传代情况，也缺乏与人类疾病的任何因果联系。

  由于其在健康婴儿以及免疫抑制个体或炎症疾病患者中的高流行率，推测其在生命早期形成免疫系统的作用。在所有BaBel婴儿和48.7%的BaBel样本中均检出了指环病毒属 contigs(图3B)。指环病毒科contig的脱落几乎是持续不断的，而且这种长期脱落并不是唯一的。contigs的丰富度在出生后的第6个月到第10个月之间达到峰值(图3C)。

  与DaMiV感染的积累相比，指环病毒contig的积累曲线和速率(图3D-F)显示发病时间要晚得多。发现日托的出勤率和时间，与一岁下半阶段指环病毒contig的积累及其积累速度显著相关。日托对指环病毒contig的积累的意义很可能只是时间意义上的混杂效应。

  图3：被检测到的指环病毒科成员概述(A)指环病毒科contigs的系统分布。(B)不同婴儿共享的指环病毒科contigs的数量。(C)一岁内的样品观测到的指环病毒科contig丰富度。(D)每个婴儿的独特的指环病毒科contigs随时间变化的数量的积累。(E)箱线图中显示了特定相关事件(开始日托、母乳、配方奶、水果、蔬菜、前半年)开始前后累计的独特指环病毒科contigs的数量。(F)每天积累的独特指环病毒科contigs的数量(即积累率)。日托前后和前半年前后，每天积累的独特指环病毒科contigs数量存在显著差异(成对)。

  假设婴儿肠道中噬菌体与宿主的关系主要是溶原性的，那么噬菌体的丰度与宿主细菌的丰度应该是时间相关的。我们首先在电脑模拟中预测了BIG噬菌体可能的细菌宿主。对于80%的BIG噬菌体，可以在科的水平上预测宿主(图4A)。这些预测宿主以拟杆菌科、双歧杆菌科、毛螺菌科、链球菌科和细孔菌科为主(图4B)。

  为了进一步支持所获得的宿主预测，对于具有预测宿主的噬菌体，可以通过共现证实(如图4C和4D所示)。在这些被证实的宿主预测中，有94%的噬菌体是在预测宿主之后或与预测宿主时一起检测到的，只有6%的情况下，噬菌体是在预测宿主之前(不久)检测到的。这些高度相关的时间动态进一步表明，婴儿肠道病毒体中的噬菌体-细菌关系在本质上主要是溶原性的。

  图4：BIG噬菌体的跨界相互作用。(A)根据使用的不同电脑模拟预测方法对BIG噬菌体进行宿主预测。(B)可以在科的水平上预测细菌宿主的BIG噬菌体数量的分布。(C) 能够成功预测和确认宿主的GMMS A特异性BIG噬菌体实例。噬菌体(下)和细菌宿主(上)随时间的共同出现情况。(D)能够成功预测和确认宿主的GMMS C特异性BIG噬菌体实例。噬菌体(下)和细菌宿主(上)随时间的共同出现情况。

  CrAss噬菌体是与人类肠道相关的最普遍的噬菌体，存在于87%到100%的成人病毒体中。在2个婴儿的22份样本中只发现了两种CrAss-Like病毒。从出生1个月开始，已在婴儿中检测到CrAss-Like病毒，认为是从母亲那里传播来的。两个contigs都是单个婴儿特异性的，预测拟杆菌属和副拟杆菌属为宿主。

  据报道，有5种真核PIV的丰度较低，所这些病毒都只在婴儿断奶时的一个样本中发现，它们显然来自婴儿的饮食(被感染的豆类、瓜类、土豆、胡萝卜、辣椒)。在三名婴儿和五份BaBel婴儿样本中只检测到一种单一、高度分化的真菌感染病毒(全病毒科)，这种真菌(及其相关的全病毒)可能来自饮食或环境。

  BaBel婴儿的婴儿肠道真菌菌群读起来像日记，与元数据变量和事件(如益生菌服用、真菌感染和抗生素治疗)强烈对应。我们的研究结果表明，在早期生命中真菌多样性非常低，并且如前所述，在早期生命中缺乏“健康的核心肠道真菌菌群”。

  总之，这项研究密切跟踪了婴儿肠道所有生命王国的群落集合。在不同的层面上，各种微生物与环境之间的复杂相互作用被展示出来。在未来的研究中，考虑宿主免疫相关因素(如抗体水平)将是有趣的，因为，特别是在生命早期，微生物组和发展中的免疫系统之间的联系是至关重要的。

  期刊信息：PANS

  IF: 12.779

  类别分区：Q1

  卷：119期：13

  文献号：2114619119

  DOI: 10.1073/pnas.2114619119