核心提示：口腔和肠道拟杆菌门产生独特的系列丝氨酸-甘氨酸脂二肽和甘氨酸氨基磷脂，通过宿主Toll-like receptor 2发出信号。这些甘氨酸脂质也在人类动脉中被检测到，但它们对动脉粥样硬化的影响尚不清楚。
——摘 要——
口腔和肠道拟杆菌门产生独特的系列丝氨酸-甘氨酸脂二肽和甘氨酸氨基磷脂，通过宿主Toll-like receptor 2发出信号。这些甘氨酸脂质也在人类动脉中被检测到，但它们对动脉粥样硬化的影响尚不清楚。在此，我们试图研究细菌甘氨酸脂在小鼠动脉粥样硬化模型中的生物活性。脂质654 (L654)是一种丝氨酸-甘氨酸脂肽，首次在高脂饲料(HFD)喂养的动脉粥样硬化模型中进行测试。腹腔注射L654 7周的高脂喂养的Ldlr -/-小鼠可产生低胆固醇作用，并显著减轻动脉粥样硬化的进展。我们发现L654还降低了肝脏炎症和细胞外基质基因表达，这可能与抑制巨噬细胞活化有关，这在体内通过较低的主要组织相容性复合体II类基因表达证明了这一点，并在细胞实验中得到证实。此外，在HFD喂养的小鼠中，粪便、肝脏和血清中的L654和其他细菌类甘氨酸脂质显著降低，同时拟杆菌相对丰度发生变化。最后，我们在Chow diet喂养的Apoe-/-小鼠中检测了L654和相关脂质567的生物活性。相比于HFD喂养的Ldlr -/-小鼠，Apoe-/-小鼠粪便中甘氨酸脂质要高得多。L654或L567连续7周可降低Ldlr -/-小鼠肝损伤标志物丙氨酸转氨酶，但在未观察到其他影响。因此，我们得出结论，在肠道微生物来源的甘氨酸脂质丢失的情况下，如HFD，可能会加剧动脉粥样硬化和肝损伤的发展，而纠正这种缺失可能会防止这些疾病的发生。
创新点：细菌源甘氨酸脂质减缓高脂饲料(HFD)引起的Ldlr -/-小鼠动脉粥样硬化和肝损伤和Chow diet引起Apoe-/-小鼠的肝损伤，但不能缓解Chow diet引起Apoe-/-小鼠的动脉粥样硬化
——实验框架——
——主要结果——
1、西式 HFD可显著降低Ldlr - / -小鼠粪便和血清中的细菌源甘氨酸脂质，并与较低的粪便拟杆菌门和较高的体重相关
为了研究饮食对细菌源甘氨酸脂质以及L654对动脉粥样硬化的影响，作者首先给雄性Ldlr - / -小鼠(6周龄)喂食西方型HFD或低脂鼠粮14周。在HFD后7周，分别给小鼠腹腔注射L654(1 μg/48 h) (HFD + L654)或对照(HFD + Veh)。
图1 西式 HFD可显著降低Ldlr - / -小鼠粪便和血清中的细菌源甘氨酸脂质和微生物多样性
2、慢性腹腔注射L654对Ldlr -/-小鼠有降血脂作用
与正常饮食喂养的小鼠相比，在HFD的最后7周腹腔注射L654导致其血清总胆固醇和NEFAs显著降低，血清HDL-C、TG、葡萄糖、胰岛素抵抗的稳态模型评估或炎症标志物(SAA、CCL2和IL-1β)没有显著影响(表2)。
3、L654降低Ldlr -/-小鼠的肝脏胆固醇、炎症和纤维化指标
H&E染色肝切片的代表性图像如图2A所示。与鼠粮组小鼠相比，HFD + Veh和HFD + L654小鼠均出现明显的空泡脂肪变性且肝脏甘氨酸脂质也降低了96%和89%(图2B)。注射L654的小鼠肝脏总胆固醇(−35%)、游离胆固醇(−17%)和胆固醇酯(−40%)较注射正常药物的小鼠显著降低，尽管肝脏TG含量没有差异(图2C)。与对照注射组相比，注射L654的小鼠血清ALT显著降低(−43%)(图2D)，表明L654减轻了这些动物的饮食诱导的肝损伤。
图2 L654注射的Ldlr - / -小鼠肝脏胆固醇和血清谷丙转氨酶(ALT)较低。
为了进一步探讨L654对肝脏的影响，作者采用RNA-Seq比较HFD + Veh和HFD + L654小鼠的肝脏转录本。经统计校正后，共有187个差异表达基因(图3A和补充表S3)。这些基因中有183个被L654下调，变化不大，为log2倍(即大多数是1倍到2倍的差异)。差异表达前25个基因如图3B所示。许多受影响的途径与非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化有关。基因集富集分析显示，这些变化在含胶原的细胞外基质通路(如Col1a1, Col1a2, Col3a1, Col6a1，基质金属蛋白酶在HFD + L654 vs. HFD + Veh)(图3C和补充表S4)。
图3 L654与载体处理的Ldlr−/−小鼠的肝脏转录组分析显示，细胞外基质和吞噬体相关通路下调。
这些纤维化和抗原提呈途径的改变通过qPCR得到证实(图4 C, D)。注射L654可显著降低几种肝脏炎症标志物的基因表达(图4A)。在脂质代谢相关基因的mRNA中只观察到轻微的变化(图4B)。与VLDL相关的胆汁酸合成基因(Cyp7a1和Cyp8b1)表达差异无统计学意义。参与VLD l分泌(Mttp和Dgat2)或脂蛋白清除(Lrp1和Pcsk9)。然而，一些胆固醇反应基因包括固醇o -酰基转移酶2(Soat2)，固醇调节元件结合蛋白2(Srebf2) (P = 0.08)，以及诱导LDL受体降解物(尽管在LDL受体缺失小鼠中不活性)，符合较低的肝脏胆固醇含量(图4 B)
图4 L654对肝脂代谢mRNA的影响有限，但降低了炎症、MHC II类和细胞外基质通路相关基因的mRNA。
为了进一步阐明甘氨酸脂在肝脏中的生理和作用，作者测试了L654和L1256在巨噬细胞中的体外作用。作者首先在RAW264.7巨噬细胞中测量PGE 2的产生和MHC II类基因表达，分别与L654、L1256、LPS或载体对照孵育24小时，然后再用LPS刺激8小时(2 μg/mL)或L1256 (2 μg/mL)稀释LPS诱导pge2的生产(图5A)。最后用IFNγ-处理的巨噬细胞，观察炎症激活状态。
图5所示。细菌源甘氨酸脂质降低LPS或IFNγ-处理的巨噬细胞的炎症激活。
4、 L654可减轻低Ldlr -/-小鼠主动脉根部动脉粥样硬化进展
图6所示。L654可显著减轻Ldlr - / -小鼠主动脉根部病变的发展。
5、L654降低了正常饲料喂养的Apoe−/−小鼠粪便中甘氨酸脂质含量
由于我们对L654生物活性的最初研究依赖于饲喂西方型HFD，它可以降低粪便中细菌源甘氨酸脂质(包括L654)，因此我们接下来研究了细菌源甘氨酸脂质对正常鼠粮喂养的Apoe−/−小鼠动脉粥样硬化的影响。
图7所示。在Chow diet喂养的Apoe−/−小鼠中，细菌源甘氨酸脂类可减轻肝损伤，但不能减轻动脉粥样硬化。
——结论与展望——
总之，目前的研究表明，拟杆菌来源的粪便甘氨酸脂质在西式HFD中显著降低，慢性腹膜内暴露于微生物来源的丝氨酸-甘氨酸脂二肽，L654，可能通过降血脂和抗炎作用防止动脉粥样硬化进展和肝损伤。在L654治疗的小鼠中发现较低的MHC II类基因表达，这表明在西方型HFD喂养的炎症损伤期间肝脏耐受部分保持。由于肠道微生物群或HFD的其他方面的改变或肥胖，耐受性的破坏可能会诱发不适当的免疫反应，导致急性和慢性炎症性肝病。因此，肠道微生物来源的甘氨酸脂质丢失的情况，如hfd引起的肥胖，可能会加剧发展动脉粥样硬化和肝损伤，而纠正这种缺失可减轻这些疾病。细菌源甘氨酸脂质和其他TLR2激动剂在宿主脂质代谢中的作用需要更多的研究。
