核心提示：抗生素耐药性对人类健康构成重大威胁。肠道微生物组被认为是抗性基因从共生体传播到病原体的潜在传播库，称为肠道抗性基因组。通常，健康人群补充益生菌或与抗生素联合使用的益生菌对肠道抗性基因组的影响是未知的。
摘要
抗生素耐药性对人类健康构成重大威胁。肠道微生物组被认为是抗性基因从共生体传播到病原体的潜在传播库，称为肠道抗性基因组。通常，健康人群补充益生菌或与抗生素联合使用的益生菌对肠道抗性基因组的影响是未知的。本研究中对未使用过抗生素的健康人的肠道宏基因组进行分析，并辅以11种益生菌菌株，并通过直接原位评估胃肠道抗性基因组，证明益生菌减少了仅在肠道中定殖细菌的抗性基因的数量。在小鼠和受试者群体中，一个疗程的抗生素治疗导致胃肠道抗性基因组的扩大，这可以通过粪便微生物组移植或在自然恢复期间缓解。相比之下，益生菌通过支持携带万古霉素抗性基因菌株的大量繁殖，进一步加剧了胃肠道粘膜中的抗性基因组扩张。
然而，上述结论并未反映在粪便样本中，这突显了不同实验方法对分析益生菌和抗生素对肠道抗性基因组研究的重要性。在其他已发表的益生菌临床试验中分析抗生素耐药基因，进一步强调了直接取样法对肠道耐药的基于个体特异性宏基因组分析的重要性。总之，本研究结果表明，益生菌对耐药体具有相反的人特异性和抗生素依赖效应，其对耐药基因在人类胃肠道传播值得进一步研究。
结论
1.粪便样本不能准确反映肠道耐药基因组
图一：粪便样本不代表GI抗性组。A. 胃肠道采样区域示意图。B. 基于ARG亚型的粪便和内窥镜样本的beta多样性分析。C. 来自末端回肠腔、下胃肠道粘膜和下胃肠道样本中ARG亚型与粪便的不同。D. 粪便样本与末端回肠腔、下消化道粘膜和下消化道内腔相比观察到的ARG类型显着降低。E. 每个区域的抗生素抗性基因类型丰富度。
实验方法：同时检查15名健康人群的粪便样本及原位抽吸物/黏膜，并分别表征他们的抗性基因组。实验结论：粪便样本不足以代表胃肠道抗性基因组，因此需要使用内窥镜样本来正确评估益生菌对肠道抗性基因组的影响。
2. 益生菌定植与内窥镜样本中 ARG
图二：粪便样本不代表未使用过抗生素和接受过治疗的个体的胃肠道耐药性。A. 探究益生菌定植与内窥镜样本中ARG负荷关系实验。B. 粪便样本与每个个体的基线期样本的Bray-Curtis差异(ARG)。C. 随时间观察粪便中的抗性基因组变化。D. 在补充益生菌之前(灰色)或补充期间(第21天，绿色)收集的消化道内窥镜样本(管腔抽吸物和粘膜)中抗性基因的Bray-Curtis差异。E与D相同，但基于ARG分型，并根据益生菌定植或抗性和时间点进行颜色编码。F. 在所有参与者或基于ARG亚型的两个子集中计算的每人Bray-Curtis与基线期的差异。G/H. 每个子集的基线期或子集之间的基线期相比，在不同个体的内窥镜样本(h)中观察到的ARG(亚型)的Alpha多样性测量(g)和Shannon指数。
实验方法：本实验分析了10名健康个体在补充商业益生菌前后和期间提供的粪便样本的宏基因组序列;在补充益生菌前和补充后第21天进行了两次肠镜检查。实验结论：益生菌对粪便ARG基因组的影响仅限于补充的第一天，及观察到的ARG数量的短暂增加。然而，益生菌显着增加了内窥镜样本与基线期的抗性基因组差异;益生菌可以以益生菌定植依赖的方式减少未使用抗生素个体肠道中的ARG，并且无法从粪便样本中验证出这种有益效果。
3.抗生素扩大了下胃肠道的抵抗力
图三：抗生素会扩大下消化道管腔中的抗药性。a，抗生素治疗和随访组的实验设计。b-d，使用7天环丙沙星和甲硝唑疗程之前(灰色)和(洋红色)并在7天内收集21个参试者的粪便样本。b，Bray-Curtis差异。e-g，21名参与者在使用抗生素(洋红色)7天后立即接受了内窥镜检查。将他们的抗性基因组与未经任何治疗的个体进行了比较(n= 15.灰色)。
实验方案设计流程：分析了21名接受抗生素治疗7天(每天2次500 mg口服环丙沙星和每天3次口服500 mg甲硝唑)的健康成人的抗性基因组。这些个体在抗生素治疗之前和治疗期间提供粪便样本，并在治疗7天后接受肠镜检查。实验结论：粪便样本不足以在原位评估抗生素诱导的肠道抗性基因组的变化。
4.抗生素治疗后，内镜样本中对比粪菌移植和自发恢复益生菌增加了ARG含量
图四：益生菌在使用抗生素后会扩大胃肠道黏膜中的抗性组。基于ARG亚型，恢复后样本与个体基线期样本的Bray-Curtis差异和曲线下面积(AUC)比对。B，与A相同但纵坐标为ARG值。C-H，参与者的下胃肠道样本中观察到不同恢复方法的ARG(c、e、g)或香农多样性指数(d、f、h)。I，抗生素治疗后和恢复21天后各组内镜标本中vanG基因的丰度。J/K，细菌种类与内窥镜样本中vanG丰度显著相关。
实验结论：
在粪便样本中，抗生素增加了所有组个体与基线期抗性基因组的差异。但益生菌组的抗性基因组恢复最慢。这可能源于益生菌组中抗性基因组的持续增加。
对从抗生素中恢复微生物组的更大抑制作用导致更大的抵抗组扩张。
益生菌对抗生素微生物组恢复的抑制作用允许可能携带扩展的临床相关ARG的物种扩展。
5.益生菌与小鼠抗生素使用后耐药性增强相关
图五：益生菌增强了抗生素治疗小鼠的胃肠道耐药性。A，实验设计方案。B，Bray-Curtis的不同之处。PC1抗生素与对照P = 0.0317.益生菌与对照P = 0.0317.益生菌与自发P = 0.0317.C/D、盲肠腔( c )或远端结肠腔 ( d )中的香农阿尔法多样性。抗生素组不包括在远端结肠组中，因为四个样本低于二次采样阈值。c，益生菌与自发恢复P = 0.0317;益生菌与对照P = 0.0317;对照与抗生素P = 0.0317.e、丰度不同组群中的vanSD基因簇及其与B. producta丰度的Spearman相关性。f、g、MGEs与vanSD丰度显着相关。
实验设计：野生型成年(10周龄)雄性C57BL/6J小鼠在饮用水中用环丙沙星和甲硝唑治疗2周，然后每天通过口服灌胃补充益生菌补充剂(Bio-25;绿色)，自体粪菌移植(黄色)或自然恢复(蓝色)在恢复28 d后被杀死，第四组在抗生素使用后立即被杀死。第五个对照组在整个42 天的实验期间未经处理(灰色)。
实验结论：
在两种不同的哺乳动物物种中，使用抗生素后补充益生菌与胃肠道中抗性基因组的增加有关。
在使用抗生素后补充益生菌，更有可能潜在地使生态位中携带ARG的菌株将ARG水平转移到其他共生体或病原体。
结论
在本研究中，通过分析来自有限人类样本的宏基因组测序数据来表征益生菌和抗生素对肠道耐药基因库的影响。本研究说明了未经抗生素治疗的人类胃肠道的粪便与肠道抽吸物和粘膜中观察到ARG的数量和类型存在显着差异，因此本研究将分析重点放在原位内窥镜胃肠道样本上。本报道说明在健康、未使用抗生素的参与者中，益生菌显著降低了肠道菌株抗性，益生菌成功定植的个体管腔样本中的ARG丰度。补充含有商业益生菌制剂可减少下胃肠道中ARG的数量;然而，这种有益效果仅限于允许益生菌定植的一部分个体。此外，用抗生素治疗会增加下消化道内腔和粘膜中ARG的数量，这可以通过粪菌移植(FMT)或自然恢复来减轻。相比之下，抗生素治疗后补充益生菌可导致下胃肠道腔中ARG数量的扩张，并进一步扩大下胃肠道粘膜中菌群抗性。在人和小鼠中，益生菌通过促进携带万古霉素抗性基因的菌株繁殖，加剧肠黏膜耐药组的抗性。
参考文献：
Montassier E, Valdés-Mas R, Batard E, Zmora N, Dori-Bachash M, Suez J, Elinav E. Probiotics impact the antibiotic resistance gene reservoir along the human GI tract in a person-specific and antibiotic-dependent manner. Nat Microbiol. 2021 Aug;6(8):1043-1054. doi: 10.1038/s41564-021-00920-0. Epub 2021 Jul 5. PMID: 34226711; PMCID: PMC8318886.
