蛋白质组最小化大肠杆菌外膜囊泡作为通用疫苗平台
原创 发布时间:2022-12-28 浏览次数: 1476 来源: 潘琪琪

核心提示:OMV由于其优异的佐剂性、用异源抗原修饰它们的可能性以及其生产和纯化过程的简单性,正成为一个有吸引力的疫苗平台。事实上,基于OMV的疫苗已经上市,而其他疫苗正处于高级临床阶段。


  60多年前,人们意外发现革兰氏阴性菌会释放外膜囊泡(OMV)。正如科学界经常发生的那样,这一发现在几年内几乎无人注意,直到最近,科学家才意识到OMV生物学的惊人方面及其在生物技术应用中的潜力。

  OMV由于其优异的佐剂性、用异源抗原修饰它们的可能性以及其生产和纯化过程的简单性,正成为一个有吸引力的疫苗平台。事实上,基于OMV的疫苗已经上市,而其他疫苗正处于高级临床阶段。基于OMV的疫苗可分为两类。第一种包括直接从感兴趣病原体中纯化的OMV构成的疫苗。第二类包括用异源抗原修饰的OMV,并从正确工程的革兰氏阴性细菌物种中获得。


  主要内容:

  1、构建大肠杆菌BL(DE3)Δ60释放的蛋白组最小化OMV

  该团队之前发布了一种基于CRISPR/Cas9的基因组编辑流程,该流程允许以每两个工作日一次突变的速度累积灭活大肠杆菌中任何可有可无的基因。通过使用该方案,尝试通过删除每个成熟蛋白编码区5′端的30个核苷酸并引入帧内终止密码子来逐步灭活90个选定基因(图1a)箭头表示根据用于CRISPR/Cas9引导的灭活的顺序。最后,获得了一株名为大肠杆菌BL21(DE3)Δ60的敲除株。除了存在于祖代大肠杆菌BL21(DE3)ΔompA菌株中的ompA基因突变外,还携带90个基因中的57个(63%)失活。

  大多数不可行的突变体是脂蛋白和周质蛋白(图1b),包括参与细胞包膜组装(9个中的5个)和分子伴侣活性(7个中的6个)的基因(图1)。


  图1 大肠杆菌BL21(DE3)Δ60菌株释放蛋白质组使OMV最小化

  2、大肠杆菌BL(DE)Δ60和OMVΔ60的特性

  与其祖先大肠杆菌BL21(DE3)ΔompA相比Δ60具有相似的生长动力学,但释放出约3倍多的OMV(图2b)。从培养上清液中纯化两种菌株的OMV,并使用带有532nm激光的Nanosight NS300装置通过电子显微镜和光散射分析其大小和质量。如图2a所示,两个样品的囊泡的大小和形态通过电子显微镜看起来非常相似,没有可见的污染或聚集体的存在。通过Nanosight分析证实ΔompA和Δ60OMV大小相似,总蛋白量相似。然后可能是由于内源蛋白的缺失(可能是对mla 途径的修改)影响了磷脂的含量,Δ60OMV的磷脂量比ΔompAOMV多2倍(图2e)。


  图2 大肠杆菌BL(DE)Δ60和OMVΔ60的特性

  根据msbB和pagP基因的失活,OMVΔ60具有TLR4激动活性和IL-6刺激能力,比OMVΔompA,低约一至三个数量级(图2f,g)。

  这些值似乎与其他OMV人类使用制剂的报告一致。OMV△60免疫小鼠的体重没有下降进一步证实该OMV的安全性(图2h)。

  3、OMVΔ60作为疫苗平台

  为了测试OMVΔ60用异源抗原/表位修饰可以引发抗原/表表位特异性免疫反应,选择了四种工程化OMVΔ60负载脂化FhuD2、HlaH35L、FhuD2-mFAT1融合和FhuD2-Bp融合,用它们免疫(i.p.)组BALB/c小鼠。免疫后,收集各组动物的血清,并通过ELISA测定抗原特异性抗体滴度。

  针对所有工程抗原诱导高IgG滴度,在用HlaH35L、FhuD2-mFAT1和FhuD2-Bp修饰的OMVΔ60的情况下,滴度比用源自祖大肠杆菌BL21(DE3)ΔompA株的工程OMV免疫的动物的滴度高约5至10倍(图3a)。

  HlaH35L OMVΔ60相对于HlaH35L OMVΔompA免疫小鼠的血清,以三倍高的稀释度抑制溶血(图3b)。说明工程化OMVΔ60免疫的小鼠与OMVΔompA免疫小鼠相比,具有更高水平的抗原特异性抗体。


  图3 OMVΔ60免疫小鼠的免疫原性和功能性免疫应答

  总结:在这项工作中,描述了使用合成生物学来创建大肠杆菌BL21(DE3)Δ60,这是一种释放OMV(OMVΔ60)的菌株,该菌株缺乏59种内源性蛋白质。该菌株产生大量的囊泡(在实验室条件下>40 mg/L),可容纳重组蛋白至总OMV蛋白的5%至30%。此外,也由于缺乏对失活内源性蛋白的免疫反应,用异源抗原/表位修饰的OMVΔ60引发了抗原/表表位特异性抗体滴度的升高。考虑到这里呈现的所有有利特征,该研究认为大肠杆菌BL21(DE3)Δ60有潜力成为新型OMV疫苗的主力工厂。

  参考文献:Zanella I, König E, Tomasi M, Gagliardi A, Frattini L, Fantappiè L, Irene C, Zerbini F, Caproni E, Isaac SJ, Grigolato M, Corbellari R, Valensin S, Ferlenghi I, Giusti F, Bini L, Ashhab Y, Grandi A, Grandi G. Proteome-minimized outer membrane vesicles from Escherichia coli as a generalized vaccine platform. J Extracell Vesicles. 2021 Feb;10(4):e12066. doi: 10.1002/jev2.12066. Epub 2021 Feb 16. PMID: 33643549; PMCID: PMC7886703.

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