核心提示:生物膜是细菌和其他微生物的主要生长形式。当微生物附着在表面上,生长或聚集在一起,并产生由聚合物质组成的细胞外基质时,生物膜可以发育。
生物膜是细菌和其他微生物的主要生长形式。当微生物附着在表面上,生长或聚集在一起,并产生由聚合物质组成的细胞外基质时,生物膜可以发育。它们占所有人类感染的65%至75%。粘细菌是大量存在于土壤中的革兰氏阴性微生物。人们广泛研究了它们在对人类无致病性的情况下产生天然抗菌化合物的能力。粘细菌可以释放外膜囊泡(OMV),粘细菌释放的OMV可以运输由其产生的抗生素化合物,已知这些化合物能够杀死浮游和细胞内病原体。
主要内容:
1 OMV对大肠杆菌生物膜的影响
为了测试这些OMV对大肠杆菌生物膜的影响,我们设计了两种不同的试验,为此,我们在24孔板中生长大肠杆菌TG1生物膜,并在孔底部插入玻璃盖玻片。在第一次试验中,我们旨在评估OMV抑制生物膜形成的能力(生物膜抑制试验)。为此,我们将细菌悬浮液与OMV或对照处理一起孵育48小时,然后进行分析。第二次试验(预成型生物膜试验)的目的是评估OMV破坏成熟生物膜的能力。为此,我们首先通过将细菌悬浮液孵育72小时来生长生物膜。随后,我们从孔中去除非粘附细菌,然后在继续分析之前再应用OMV处理24小时。使用生物膜抑制试验的扫描电子显微镜(SEM),我们观察到,与对照组相比,OMV处理组中附着在盖玻片表面的细菌更少(图1A),表明OMV处理防止了细菌附着在盖膜表面,并且这种效应是剂量依赖性的。在预先形成的生物膜测定中也观察到类似的效果,特别是当用Cbfedered OMV处理粘附的生物膜时(图1B)。这表明OMV处理可以促进细菌从玻璃盖玻片表面脱离,并破坏成熟的生物膜。
图1 玻璃盖玻片上生长的大肠杆菌生物膜的扫描电子显微照片
2 OMV处理不能抑制活细菌细胞的存在
在两次生物膜测定后使用荧光测定评估了生物膜中的细菌生存能力。
将生物膜接种在黑色、透明的底部96孔板中,然后使用LIVE/DEAD BacLight细菌细胞活力试剂盒染色。该试剂盒包含染料Syto9(绿色)和碘化丙啶(红色),它们会对所有细菌细胞进行染色,碘化丙锭会通过破坏的细胞膜进入细胞,对其核酸进行染色,从而使完整的(绿色)细胞和非完整的(红色)细胞区分开来。然后使用自动荧光显微镜(LionheartFX)对平板进行成像。
使用微板读取器评估荧光强度。在生物膜抑制试验中,对照处理(Lysogeny肉汤[LB]、PBS和囊菌酰胺)促进了均匀生物膜层的形成(如图),表明成熟生物膜含有活菌。
图2 生物膜抑制试验
使用微板读取器评估荧光强度。在生物膜抑制试验中,对照处理(Lysogeny肉汤[LB]、PBS和囊菌酰胺)促进了均匀生物膜层的形成(图2),表明成熟生物膜含有活菌。然而,当用囊巴坦和OMV悬浮液处理生物膜时,与PBS对照处理相比,荧光强度没有显著降低(图3)。这一结果表明,处理不能抑制活细菌细胞的存在。
图3 生物膜抑制试验:微量板读取器检测到Syto9(活细菌)的平均荧光强度
3 OMV可能通过作用于生物膜特定成分(如细胞外基质)而发挥抗聚集和抗生物膜活性
在预成型生物膜测定中,我们观察到当大肠杆菌与LB培养基孵育时,形成大的生物膜团块,这是成熟生物膜的典型特征(如图4)。
此外,在预成型生物膜测定中,用任何OMV稀释液处理都会导致细菌细胞的Syto9荧光信号较低,而没有观察到生物膜形成。
图4 预成型生物膜测定
图5 预成型生物膜测定:微量板读取器检测到Syto9(活细菌)的平均荧光强度
微板读取器分析表明,与所有OMV稀释液相关的Syto9荧光强度显著低于PBS对照处理获得的荧光强度,但彼此之间趋于可比(如图)。尽管如此,没有记录到生物膜的形成。
结果表明,OMV处理可能不会对生物膜中的细菌产生直接的溶菌作用,而是可能通过作用于生物膜特定成分(如细胞外基质)而发挥抗聚集和抗生物膜活性。
4 OMV对生物膜细胞外基质的总体影响
为了研究OMV对生物膜细胞外基质的总体影响,用100µL的20µg mL−1 Hoechst 33342溶液对预成型生物膜测定中产生的生物膜进行进一步染色,一种与DNA结合的染料(蓝色),DNA是生物膜的常见细胞外成分(绿色为全部细胞)。
处理24小时后预成型生物膜测定的共焦激光扫描显微镜。用PBS、囊巴坦或乙醇(EtOH)处理后,与LB处理的样品相比,生物膜的厚度减小。用最高浓度的Cbv OMV(1:10稀释)处理导致更多的细菌膜受损(红色为受损细胞);然而,生物膜的厚度与LB处理的样品的厚度相似。第二高浓度Cbv OMV(1:100稀释)处理的生物膜呈现出不规则的结构,而最低浓度(1:1000稀释)处理降低了生物膜的厚度。与LB培养基对照处理相比,所有浓度的Cbfe OMV处理都降低了生物膜厚度。
图6 处理24小时后预成型生物膜测定的共焦激光扫描显微镜
为了进一步研究处理对细菌细胞的影响,使用RedoxSensor Green(RSG)细菌活力试剂盒和流式细胞仪进行了细菌活力测定。 RSG是一种代谢活性生物传感器,通过参与有氧代谢的细胞内还原酶降低,从而释放代表细菌细胞代谢的稳定绿色荧光。结果表明,在用最高浓度的Cbv和Cbfe OMV悬浮液处理后,细菌细胞活力显著降低(图7A,B),这表明这些治疗降低了细菌细胞的代谢活性,并可能与经典抗生素一起用于治疗生物膜感染。
图7 处理24小时后,用RedoxSensor Green(RSG)试剂染色,对预先形成的生物膜进行流式细胞术分析。
5 OMV治疗对致病细菌的影响
为了模拟心肌炎和导管相关性尿路感染等感染,生物膜必须承受流体流动,并研究OMV治疗对致病细菌的影响,表皮葡萄球菌在微流体室中在恒定流量下生长。当细菌暴露于胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)培养基(对照)8小时时,生物量随时间增加细菌生长进一步导致了生物膜三聚结构的形成。
相比之下,连续OMV治疗对表皮葡萄球菌生物膜形成产生抑制作用。有趣的是,在这些流动条件下,用来自任一菌株的OMV处理显著抑制了细菌附着到玻璃表面和生物膜生长。
这些数据表明,即使在生理相关的流动条件下,粘细菌OMV也具有作用于生物膜成分并抑制生物膜形成的独特能力。
图8 Cbfe23和Cbv34 OMV在流动条件下抑制表皮葡萄球菌生物膜的形成。
总结:许多微生物利用生物膜的形成作为在环境中生存的机制。这使他们对抗生素产生耐受性,导致难以治疗的感染。在这项研究中,评估了来源于velatus Cbv34和Ferragineus Cbfe23的天然抗生素负载的OMV对生物膜和生物膜形成的影响。研究发现,OMV降低了生物膜的活力,能够将其从静态培养条件下生长的表面分离,并防止在流动条件下生物膜生长,从而显示出其在治疗这些感染中的潜在适用性。
参考文献:Goes A , Vidakovic L , Drescher K , Fuhrmann G . Interaction of myxobacteria-derived outer membrane vesicles with biofilms: antiadhesive and antibacterial effects. Nanoscale. 2021 Sep 14;13(34):14287-14296. doi: 10.1039/d1nr02583j. Epub 2021 Aug 2. PMID: 34477714.