多组学整合分析揭示肠道微生物组相关代谢物在结直肠癌和腺瘤检测中的作用

核心提示：通过非靶向血清代谢组学分析和配对粪便样本宏基因组测序，识别CRC和腺瘤患者中丰度显著改变的肠道微生物组相关代谢物。通过靶向代谢组学分析检测这些代谢物区分CRC和结直肠腺瘤的能力。

导读

目的：分析血清中肠道微生物组相关代谢物，并研究这些代谢物能否将结直肠癌(CRC)或腺瘤患者与正常健康个体区分开来。

方法：通过非靶向血清代谢组学分析和配对粪便样本宏基因组测序，识别CRC和腺瘤患者中丰度显著改变的肠道微生物组相关代谢物。通过靶向代谢组学分析检测这些代谢物区分CRC和结直肠腺瘤的能力。建立了一个基于肠道微生物相关代谢物的模型，并在独立验证队列中进行了评估。

结果：在CRC和腺瘤中，共有885种血清代谢物发生了显著改变，包括8种肠道微生物组相关血清代谢物(GMSM组)，这些代谢物通过靶向和非靶向代谢组学分析可重复检测，并准确区分CRC和腺瘤与正常样本。基于GMSM组的模型预测CRC和结直肠腺瘤，模型队列的曲线下面积(AUC)为0.98(95%CI 0.94-1.00)，验证队列的AUC为0.92(敏感性83.5%，特异性84.9%)。在验证队列的样本中，GMSM模型显著优于临床标志物癌胚抗原(AUC 0.92 vs 0.72)，并且对腺瘤(AUC=0.84)和早期CRC(AUC=0.93)具有良好的诊断准确性。

结论：CRC患者肠道微生物组重编程与血清代谢组的改变有关，GMSMs在CRC和腺瘤检测中具有潜在的应用价值。

论文ID

原名：Integrated analysis of the faecal metagenome and serum metabolome reveals the role of gut microbiome-associated metabolites in the detection of colorectal cancer and adenoma

译名：粪便宏基因组和血清代谢组整合分析揭示肠道微生物组相关代谢物在结直肠癌和腺瘤检测中的作用

期刊：Gut

IF：31.793

发表时间：2021.11

通讯作者：崔巍

通讯作者单位：中国医学科学院北京协和医院

DOI号：10.1136/gutjnl-2020-323476

实验设计

结果

1、来自发现队列的血清半定量非靶向代谢组学分析显示CRC和腺瘤患者的代谢物发生显著改变

肿瘤的发生伴随着局部组织和循环系统中代谢物状态的整体改变。为了研究血清代谢组与结直肠腺瘤或癌症之间的关系，我们在发现队列中通过代谢组学分析进行了非靶向代谢组学分析(图1A)。发现队列被分为三个人群：正常健康人群(N，n=31)、腺瘤患者(A，n=12)和CRC患者(C，n=49)(图1B)。首先过滤掉低丰度信号(所有三个人群中的平均丰度<5000)。在负离子模式和正离子模式下，检测到的每个代谢物的预期混合比和实测混合比之间的线性回归模型R2值的分布如图1C所示，表明超过50%的代谢物的R2值大于0.9，表明我们代谢物检测的准确性，以及这些代谢物在此浓度范围内稳健的线性关系。此外，我们还使用汇总的CRC样本(C-pool)作为QC分析了所有代谢物特征的变异系数(CV%)，并观察到超过90%的这些特征的CV小于15%(在线补充图S1C)，表示不同检测批次之间的稳定性。接下来，我们探索了在不同种群对(C vs N、A vs N和C vs A，校正后的p<0.005，倍数变化>1.2或<0.8)之间丰度显著改变的代谢物。基于所有这些改变的代谢物的主成分分析(PCA)图中所有样品的分布(图1D)揭示了腺瘤和癌症患者的相似模式，而正常人群可以从这两个人群中清楚地区分出来。在进一步比较三对中显著改变的代谢物时，C vs N与A vs N显示出最显著的相似性，表明肿瘤发生已经在腺瘤阶段诱导了显著的血清代谢变化(图1E)。在C vs N和A vs N中显著改变的代谢物(总共1426个代谢物特征)，被称为“结直肠异常相关代谢物”，由于它们在肿瘤进展过程中表现出早期和持续的改变，因此被用于进一步分析。在1426个代谢物特征中，有885个可以被注释(在线补充表S2)，这些代谢物在发现队列中的相对丰度显示在图1F中。基于这些代谢物，还可以明确区分异常结直肠患者(C和A)和正常个体(图1G)。

图1 与正常人群相比，结直肠癌(CRC)和腺瘤患者血清代谢组改变的概况。(A)图表显示了实验设计和分析程序。在发现阶段，在发现队列中进行了非靶向代谢组学分析和宏基因组测序，血清和粪便匹配队列，揭示了与肠道微生物组相关且在腺瘤和CRC患者中发生显著改变的代谢物的血清代谢物谱，并在发现队列中进行靶向代谢检测以选择候选代谢物生物标志物;基于生物标志物组，在建模队列中建立诊断模型并确定临界值;在验证阶段，将建模队列中确定的临界值直接转移到一个独立的验证队列，以验证诊断模型的性能，包括其阶段特异性性能以及与临床CEA标志物的比较。(B)显示了参与本研究的队列的组成。对于发现、建模和验证队列中的个体，仅收集血清样本。在血清和粪便匹配队列中收集了同一个体的粪便和血清样本。N：正常人群(蓝色);A：腺瘤(红色);C：CRC患者(绿色)。(C)负离子模式(左)和正离子模式(右)下非靶向代谢组特征的R2值分布。R2值表示每种代谢物的预期N-pool/C-pool混合比与实测N-pool/C-pool混合比之间的相关性。(D)PCA图显示了正常人群(N，蓝色)、腺瘤患者人群(A，红色)和CRC患者人群(C，绿色)样本的血清代谢组学状态差异，这些差异基于所有显著改变的代谢物。(E)韦恩图显示了3个改变的代谢物对(A vs N和C vs A和A vs C)之间的重叠。N：正常人群;A：腺瘤患者;C：结直肠癌患者。(F)热图显示与正常人群(N，蓝色)相比，腺瘤(A，红色)和CRC(C，绿色)患者的代谢物丰度发生显著改变。(G)基于与正常个体相比在腺瘤和CRC患者中显示出显著变化的代谢物，PCA图显示正常个体(N，蓝色)、结直肠异常(A，红色)和CRC患者(C，绿色)之间有明显区别。CEA，癌胚抗原;LC-MS，液相色谱-质谱;PCA，主成分分析。

2、异常结直肠患者血清中肠道微生物组相关代谢物显著改变

异常结直肠患者中微生物组组成的改变有助于局部代谢组谱的重编程。然而，这些与结直肠肠道微生物群异常相关的变化是否会导致血清代谢组的重编程仍不清楚。为了进一步研究肠道微生物组与结直肠异常相关血清代谢物之间的关联，并确定这些微生物组相关代谢物对预测结直肠异常的潜在贡献，我们通过对粪便样本的宏基因组图谱与匹配血清样本的代谢组进行相关分析，在血清和粪便匹配队列中进行了整合微生物组-代谢组分析(图2A)。在血清和粪便匹配队列中总共有44个个体的数据通过QC，并用于后续分析。宏基因组数据的分类分析揭示了12 455种微生物。在这些物种中，我们观察到产肠毒素细菌脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis (ETBF)升高，该细菌被认为是CRC起始的关键病原体(图2B，以红色突出显示)。其他几种促进CRC的物种，包括具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、微小微单胞菌(Parvimonas micra)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)均显著上调(图2B，以红色突出显示)，而长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)等益生菌在CRC患者中的表达下调(图2B，以蓝色突出显示)。这些CRC相关物种的丰度变化与之前的报告一致。

筛选出平均丰度小于5000的代谢物。考虑至少一个个体中相对丰度高于0.1%的肠道微生物物种。在12 455个物种中，有640个物种通过了此筛选。随后对33例CRC患者的肠道菌群种类和代谢物进行Pearson相关系数分析。显著相关的临界值设置为p<1E-3，此时的错误发现率为18%(图2C)。在相关物种-代谢物配对中，发现队列中鉴定的885种结直肠异常相关代谢物中有322种代谢物特征(详细的关联评分列于在线补充表3)。这些代谢物与肠道微生物群显著相关，包括报道的与CRC起始和进展相关的细菌种类(在线补充表4a)，例如促进CRC的具核梭杆菌、微小微单胞菌、Alistipes finegoldii和Odoribacter splanchnicus(在线补充表4a和图2D，以红色突出显示)，以及益生菌，如长双歧杆菌和Parabacteroides distasonis(在线补充表4a和图2D，以蓝色突出显示)。通过评估微生物组相关代谢物在预测结直肠癌异常方面的潜在贡献，我们观察到与这些CRC相关微生物组相关的63种代谢物可以解释发现队列中正常和结直肠癌异常代谢物之间的总变异(样本外R2=0.87)的87%，而885种结直肠异常相关代谢物解释了总变异的93%(样本外平均R2=0.93)。通过绘制这些代谢物的相对丰度，我们观察到在异常结直肠患者中，与肿瘤促进菌种相关的代谢物显著富集。相比之下，益生菌相关代谢物在正常人群中富集，根据代谢物分布可以明确区分正常个体和异常结直肠患者(图2E)。这些观察结果表明，CRC相关的微生物组物种与血清代谢物的变化密切相关。除了先前表征的CRC相关物种外，这些代谢物还与大量其他与结直肠异常相关的未知物种密切相关(图2D和在线补充表4a，灰色)。其中一些物种在正常个体和异常结直肠患者之间也显示出显著的丰度改变(在线补充表4b中总结)，如Enterobacter hormaechei(C vs N倍数变化=6.23，p=0.021)和Peptostreptococcaceae bacterium(C vs N倍数变化=0.602，p=0.049)，表明它们在结肠癌进展过程中的潜在作用。

为了进一步支持我们数据集中定义的微生物组和血清代谢物之间的关联，我们以次级胆汁酸为例，因为据报道其代谢与肠道微生物组和CRC进展密切相关。由肝脏分泌的结合胆汁酸(如牛磺酸-CA/乙二醇-CA)被具有胆汁盐水解酶活性的微生物解共轭，而游离的未结合初级胆汁酸(CA)随后可通过某些细菌物种(包括Clostridiaceae和Eggerthellaspp.)中编码的胆汁酸诱导基因簇转化为去氧胆酸(DCA)(在线补充图S2A)。这些胆汁酸可能会在肠道中被重新吸收并进入循环系统。为了进一步直接评估CRC相关肠道微生物组对血清代谢的影响，我们分析了异常结直肠患者与正常个体之间CA和次级胆汁酸(DCA)丰度的变化。在异常结直肠患者血清中未结合CA和DCA的浓度上调(在线补充图S2B，C)。进一步的相关性分析揭示了肠道微生物物种与这些胆汁酸的关联，例如，Fusobacterium pseudoperiodonticum与游离CA呈显著正相关(在线补充图S2D，上图)，而Bilophila wadsworthia(据报道胆汁酸可以刺激其生长)与DCA相关(在线补充图2，下图)。这些物种在CRC人群中的比例也过高(在线补充图S2E)，这与之前的研究结果一致。

我们还研究了这些肠道微生物相关代谢物是否在结肠组织中发生改变。环境MSI应用于9对来自结直肠腺瘤或肿瘤活检的新鲜冷冻组织和邻近正常组织，以比较代谢物的相对含量。如在线补充图S3所示，与邻近正常组织相比，肿瘤/腺瘤组织中代谢物N,O-双-(三甲基甲硅烷基)苯丙氨酸的丰度显著上调(在线补充图S3A);在异常结直肠患者的血清中也观察到类似的变化(在线补充图S3B)。此外，在33例异常结直肠患者中，N,O-双-(三甲基甲硅烷基)苯丙氨酸还与Clostridiales bacterium VE202-01(r=0.586, p=3.4E-4)和Erysipelatoclostridium ramosum(r=0.549, p=9.34E-4)等几种物种呈显著正相关。在(在线补充表S3)，并且这些物种的相对丰度在异常结直肠患者中也显示上调(在线补充图S3C)，表明CRC相关微生物组重编程可能正向调控该代谢物的生物合成，并反映在血清代谢组中。总体而言，这些结果支持CRC相关的肠道微生物组可能会导致特定血清代谢物的改变。

图2 通过整合粪便宏基因组和血清代谢组分析，研究异常结直肠患者肠道微生物组相关血清代谢物的显著变化。(A)图显示了血清和粪便匹配队列(11名正常个体，33名腺瘤和CRC患者)中粪便宏基因组和血清代谢组的综合分析程序。在该队列中进行了血清样本的非靶向代谢检测和粪便样本的宏基因组测序。根据它们的相对丰度计算正常和结直肠异常的群体之间显著改变的微生物物种。对33例异常结直肠患者进行Pearson相关系数分析，建立肠道微生物组相关血清代谢物谱。此外，我们使用MSI和胆汁酸的相关结果来进一步支持我们的相关分析的可靠性。(B)在匹配队列的正常个体和异常结直肠患者中，几种CRC相关肠道微生物菌群的相对丰度(红色表示肿瘤促进菌群，蓝色表示益生菌)。(C)每种血清代谢物和肠道微生物物种之间的Pearson相关系数分布(临界值：p<1E-3，FDR ≤18%)。(D)显示CRC相关肠道微生物与其相关血清代谢物之间协变的Sankey图。先前报道的在结直肠癌中促进肿瘤的代谢物和物种之间的关联用红色表示，而代谢物和抗肿瘤物种之间的关联用蓝色表示。灰线代表这些代谢物与其他细菌物种的关联，它们在CRC中没有明确的作用。这些代谢物颜色代码的含义如下：与CRC促进物种相关的代谢物(紫色)，与抗肿瘤物种相关的代谢物(绿色)，与抗肿瘤和促肿瘤物种相关的代谢物(深蓝色)，这与图2E中的颜色代码一致。(E)热图显示发现队列中与CRC促进物种(紫色)、抗肿瘤物种(绿色)或抗肿瘤和肿瘤促进物种(深蓝色)相关的代谢物的相对丰度。腺瘤和结直肠癌患者中促肿瘤物种相关的代谢物显著富集，而正常个体中与抗肿瘤物种相关的代谢物较高。根据代谢物与促肿瘤物种的关联指数(热图右侧的列)对所有个体进行排序。基于该值，正常个体(浅蓝色)与异常结直肠患者(红色)可以明显区分开来。CRC, ryonic anti;FDR，错误发现率;GMSM，肠道微生物组相关血清代谢物;MSI，质谱成像。

3、一组GMSM可以预测发现队列中的结直肠异常

基于上述322种GMSM，我们使用LASSO算法来识别用于检测结直肠异常的关键代谢物生物标志物(图3A)。LASSO运行200次后，共有32种代谢物特征在75%以上的时间内一致出现(在线补充表5)。其中，8种代谢物可以被可靠地鉴定出来，在非靶向和靶向代谢组学检测中均显示出一致的上调或下调趋势，表明这些代谢物可以通过不同的方法稳定检测(图3A、B、表1)。

我们随后评估了该代谢物组在区分发现队列中的正常个体和异常结直肠患者方面的预测准确性。基于非靶向代谢组学分析检测到的相对丰度，可以准确区分发现队列中的正常个体和异常结直肠患者，曲线下面积(AUC)为0.95(95%CI 0.85-1.00)(图3C)。

接下来，从注释的代谢物中鉴定了8个前体和产物离子对(详细信息可在在线补充方法中获得)。它们与上述非靶向代谢组学分析中为模型选择的8种代谢物相对应(图3C)。基于上述8个离子对组的模型在同一个体队列中进行训练，以确定这些离子对是否可以在靶向代谢组学分析中将结直肠腺瘤(CRA)/CRC与正常个体区分开来。结果显示，靶向代谢组的AUC为0.95(95%CI 0.85-1.00)(图3E)，与非靶向代谢组学分析结果相似。通过非靶向和靶向代谢组学分析，PCA图显示正常个体和异常结直肠患者明显分离(图3D、F)。

此外，这8种代谢物在区分血清和粪便匹配队列中的腺瘤/CRC与正常个体方面也表现出显著的准确性，AUC为0.96(95%CI 0.84-1.00)(图3G)。来自中国医学科学院肿瘤研究所(绿点)和山东省(SD)(红点)两个中心的异常结直肠患者在PCA图中聚类，与正常个体(蓝点)明确分开(图3H)。结果，发现了一个GMSM组(由8个GMSM组成)，它具有检测结直肠异常的潜力。表1 非靶向和靶向代谢组学分析中GMSM组的代谢物及其血清丰度和方差。

图3 一组肠道微生物相关的血清代谢物可以预测结直肠异常。(A)图显示了GMSM组中涉及的代谢物选择过程。在发现队列的异常结直肠患者显著改变的885种代谢物中，32种代谢物与肠道微生物组相关。进一步使用LASSO算法筛选关键代谢物，在200次LASSO检测中，32种代谢物一致出现的时间超过75%。评估其用于靶向MRM分析的可行性，并在发现队列中进行靶向代谢检测。最后，8种代谢物在同一队列中的靶向和非靶向代谢组学分析中显示出一致的差异。选取这些代谢物作为GMSM组，进一步构建模型。(B)镜像图显示了推断代谢物的实验MS2谱和来自公共数据库的相关代谢物的MS2谱。左图：(Z)-5,8,11-trihydroxyoctadec-9-enoic acid(X14.3_329.233mz neg);右图：(E)-2-(4,8-dimethylnona-3,7-dien-1-yl)-5-hydroxy-2,7-dimethyl-2H-chromene-8-carbaldehyde(X27.8_353.212mz_neg)。(C)发现队列中基于非靶向代谢组学检测的GMSM组区分正常个体和异常结直肠患者的ROC曲线。(D)PCA图显示了发现队列中基于非靶向代谢组学检测的GMSM组对正常个体和结肠直肠癌异常个体的区分。发现队列中基于靶向代谢组学检测的CRC GMSM组用于区分正常个体和异常结肠直肠患者的ROC曲线。(F)PCA图显示了发现队列中基于靶向代谢组学检测的GMSM组对正常个体和异常结直肠患者的区分。(G)血清和粪便匹配队列中基于非靶向代谢组学检测的CRC GMSM组用于区分正常个体和异常结直肠患者的ROC曲线。(H)PCA图显示了血清和粪便匹配队列中基于非靶向代谢组学检测的GMSM组对正常个体和异常结直肠患者的区分。GMSM组还可以准确区分正常个体(蓝点)和来自两个独立来源的异常结直肠患者(绿点表示来自CICAMS的患者;红点表示来自SD的患者)。CICAMS，中国医学科学院肿瘤研究所;CRC，结直肠癌;GMSM，肠道微生物组相关血清代谢物;MRM，多反应监测;PCA，主成分分析;ROC，受试者操作特性。

4、基于GMSM组的预测模型对验证队列中腺瘤和CRC患者的检测显示出良好的结果

基于发现队列中鉴定的代谢物组，模型队列招募了192名个体，包括72名正常个体和120名异常结直肠患者(在线补充表S1)，并采用靶向多反应监测方法测量8种GMSM代谢物的相对丰度。使用逻辑回归方法生成了一个预测模型，在建模队列中AUC达到0.98(95%CI 0.94-1.00)(图4A)。为达到最高准确度，生物标志物评分的临界值设置为0.438(图4B)，导致建模队列的敏感性为96.7%，特异性为90.3%。

接下来，我们在由103名异常结直肠患者和53名正常个体组成的独立验证队列中评估了GMSM模型的性能(在线补充表S1)。在这个独立验证队列中，GMSM模型的AUC达到0.92，敏感性为83.5%，特异性为84.9%(图4C)。我们还分别检查了该模型对验证队列中异常结直肠患者腺瘤到晚期癌症的阶段特异性性能。我们的模型(AUC为0.84)将腺瘤患者与正常健康个体区分开来。对于早期/中期(I/II期)CRC患者，AUC为0.93，而对于晚期(III/IV期)CRC患者，AUC达到0.91(图4D)。使用先前建立的最高准确度临界值，对结直肠腺瘤和早期/中期CRC(I/II期)的敏感性分别达到63.2%和88.2%，而对结直肠腺瘤和早期/中期CRC的特异性为84.9%。我们的数据表明了GMSM模型在CRC早期检测方面的潜力。

图4 基于CRC GMSM组的预测模型对腺瘤患者以及早期和晚期CRC患者显示出良好的诊断价值。(A)建模队列中基于GMSM组的预测模型的ROC曲线，AUC为0.98(95%CI 0.94-1)，敏感性和特异性分别为94.2%和92.5%。(B)模型队列中正常个体和异常结直肠患者的CRC和腺瘤生物标志物特征评分的分布。为了实现高精度，CRC和腺瘤生物标志物特征评分的诊断临界值设置为0.438。(C)ROC曲线显示了验证队列中CRC GMSM模型在临界值为0.438(AUC=0.92，敏感性83.5%，特异性84.9%)下的鉴别准确性。标记了ROC曲线上截止值的位置。(D)ROC曲线显示验证队列中CRC GMSM模型对腺瘤(AUC=0.84，敏感性63.2%，特异性84.9%)、I期和II期CRC(AUC=0.93，敏感性88.2%，特异性84.9%)以及III/IV期CRC(AUC=0.91，敏感性84.2%，特异性84.9%)的鉴别准确性。标记了不同阶段ROC曲线上的截止值位置。AUC，曲线下面积;CRC，结直肠癌;GMSM，肠道微生物组相关血清代谢物。

5、GMSM模型在检测结直肠异常方面优于临床生物标志物CEA和FOBT

为了比较临床使用的标志物CEA和我们的GMSM模型检测CRC和腺瘤的效率，我们评估了它们在验证队列中的性能，并记录了该验证队列中所有个体的血清CEA水平。使用临床上截断值为5 U/mL的CEA检测结直肠异常，AUC为0.72，敏感性为35.8%，特异性为86.4%。相比之下，我们的GMSM模型的AUC达到了0.92(敏感性为83.5%，特异性为84.9%)，远高于CEA(图5A,B)。

此外，我们还将GMSM模型与目前用于CRC筛查的FOBT/FIT分析进行了比较。为此，我们分析了CRC患者的医疗记录，发现89名患者接受过FOBT/FIT检测;其中58名患者的FOBT/FIT测试结果为阳性，31名患者的FOBT/FIT结果为阴性，敏感性为65.2%，与之前的报告相当。这些结果表明，本研究的GMSM模型在检测CRC方面优于FOBT/FIT测试。

图5 比较CRC GMSM模型和CEA生物标志物的性能。(A)显示CEA鉴别准确性的ROC曲线(红线，AUC=0.72;验证队列中CRC GMSM模型(蓝线，AUC=0.92，在临界值0.438下敏感性83.5%，特异性84.9%，蓝点标记)的敏感性为35.8%，特异性为86.4%。(B)GMSM模型(红色虚线)和CEA(临床截断值，蓝色虚线)在区分验证队列中正常个体(绿点)和异常结直肠患者(红点)方面的图形比较的散点图。在相似的特异性水平下，我们的GMSM模型的敏感性大大优于CEA标志物。CEA，癌胚抗原;CRC，结直肠癌;GMSM，肠道微生物组相关血清代谢物;ROC，受试者操作特性。

讨论

代谢谱分析正在成为一种检测不同肿瘤的有效方法。在本研究中，我们使用代谢组学分析来开发CRC和腺瘤检测模型。我们的模型表现出比临床使用的生物标志物CEA和最近报道的使用一系列蛋白质标志物和cfDNA热点突变的血浆生物标志物组更高的准确性。我们的结果表明，GMSM组可能是一种有前景的非侵入性CRC和腺瘤检测方法。

与先前报道的基于血清的代谢组相比，我们的GMSM组只比较了正常个体和CRC个体之间的血清代谢组，GMSM组由特征代谢物组成，这些代谢物应该是与CRC相关的肠道微生物组改变的结果。数学模型将70%-90%的癌症风险归因于环境因素，而肠道微生物组已被认为是大肠中的主要环境因素。最近新出现的证据表明，肠道微生物组可能通过不同的机制诱导肿瘤发生和CRC进展。虽然CRC发生的确切原因尚不清楚，但对于单个微生物或群落被认为是致癌的，它们必须引起致癌作用，比如造成DNA损伤。在本研究中，我们观察到CRC患者的ETBF升高(ETBF，图2B，以红色突出显示)。纯化的脆弱拟杆菌毒素上调HT29/c1和T84结肠上皮细胞中的SMO，导致SMO依赖性活性氧(ROS)的产生和DNA损伤的诱导。此外，一些细菌代谢物也与CRC相关，例如次级胆汁酸。在本研究中，非结合CA和DCA的血清浓度在异常结直肠患者中上调(在线补充图S2B)。此外，相关性分析揭示了一系列肠道微生物物种与这些胆汁酸之间的关联(在线补充图S2D)。胆汁酸通过产生ROS和活性氮物质促进肠道不同区域的癌变，这两种物质都会导致DNA损伤。因此，通过关注GMSM，我们可以获得对结肠癌更具特异性的肿瘤检测组。本研究的GMSM组在独立验证队列中可达到83.5%的敏感性和84.9%的特异性，高于其他血清组。

此外，对于CRC的检测，基于粪便样本已得到广泛研究。虽然本研究进行了回顾，但一项基于粪便样本16S测序的独立研究进一步报告称，基于11种微生物标志物，结直肠腺瘤患者可以与正常个体区分开来，其AUC为0.80。通过直接结合粪便样本的代谢组学和宏基因组学分析，可以揭示结直肠腺瘤和早期/晚期CRC的阶段特异性肠道微生物组和代谢物特征。此外，据报道，血液中的代谢物与各种生理或病理条件下的肠道微生物组有关。然而，CRC患者中与肠道微生物组相关的血液代谢物以前从未被研究过。尽管揭示肠道微生物组中特定菌株的活性与血液中达到平衡的代谢物之间关联的算法仍在积极开发中，但Pearson相关、Spearman相关性以及MMVEC神经网络或基于贝叶斯概率的建模方法已广泛应用于相关研究。由于统计假设的差异，各种算法可能揭示肠道微生物组和代谢物之间复杂相互作用的不同方面。尽管如此，包括Spearman和MMVEC在内的许多方法能够揭示炎症性肠病队列中肠道微生物组相关代谢物的类似发现。因此，我们使用相关性分析来揭示血液代谢物与源自和/或受肠道微生物组影响的活动的潜在关联。

我们的方法确定了一系列与肠道微生物物种相关的代谢物，包括具核梭杆菌和长双歧杆菌，实验表明它们分别促进和抑制CRC进展。本研究进行了两项实验以进一步评估肠道微生物组与血清代谢物之间的关联。首先，对CA或DCA与肠道微生物组之间关联的研究表明，CA和DCA的浓度与具有胆汁酸催化活性的物种高度相关(在线补充图S2D)。其次，CRC患者血清和肿瘤组织中的特定代谢物，如微生物代谢物N，O-双-(三甲基甲硅烷基)苯丙氨酸在血清和结直肠异常组织中均增加。这些代谢物与细菌物种(包括C. bacterium VE202-01和E. ramosum)之间的正相关关系表明，可能存在与肿瘤发生相关的微生物组重编程，这可以通过这些代谢物的血清水平进行监测。与我们的研究结果一致，Clevers博士团队报告称，pks+大肠杆菌通过大肠杆菌素在人类肠道类器官中诱导CRC突变特征，这是肠道相关血清代谢物介导的CRC肿瘤发生和进展的潜在机制的基础。因此，我们的研究结果支持这一理论，即血清中的肠道微生物组相关代谢物在检测CRC方面具有很大的潜力。

需要指出的是，本研究存在一些不足之处。需要更多的腺瘤患者，特别是晚期腺瘤和早期CRCs，以证实我们的方法可以应用于癌症早期检测。通过整合正常人群和CRC人群的粪便宏基因组和血清代谢组分析，发现了结直肠异常与血清代谢特征之间的关联。本研究建立了一个基于代谢物的高精度CRC检测预测模型。