编码益生菌在有效口服给药后调节炎症和肠道菌群以治疗肠道炎症

为了提高ECN-pE在胃肠道中的生物利用度，壳聚糖和海藻酸钠通过逐层静电自组装策略包埋ECN-pE。在不同化学药物诱导的小鼠IBD模型中，壳聚糖/海藻酸钠涂层的ECN-pE (ECN-pE(C/A) 2) 有效缓解炎症，修复结肠上皮屏障。出乎意料的是，这种工程化的EcN-pE(C/A) 2还可以调节肠道微生物群落，提高肠道菌群中Lachnospiraceae_NK4A136和Odoribacter的丰度，这些是维持肠道稳态的重要微生物。因此，这项研究为使用益生菌治疗肠道相关疾病的开发奠定了基础。

图1针对治疗肠炎的工程益生菌

结果

1. ECN-pE(C/A) 2的制备与表征

图2 ECN-pE(C/A)2的表征

Escherichia coli Nissle 1917 (ECN)是常见益生菌，用含有cat和sod基因的pET28a-T5载体稳定表达CAT和SOD(CAT过氧化氢酶、SOD超氧化物歧化酶)。为了保护ECN-pE在胃肠道中的活性，选择具有生物相容性和可生物降解性的壳聚糖和海藻酸钠使用逐层静电相互作用策略堆叠在ECN-pE上。研究表明，双层壳聚糖/海藻酸钠涂层使ECN在胃肠道的存活率大大提高，显着提高ECN-pE在胃肠道中的生物利用度且壳聚糖/海藻酸钠涂层几乎不影响CAT和SOD的表达。

2. ECN-pE(C/A) 2对IBD的治疗效果评估

图 3 ECN-pE(C/A)2对DSS诱导的小鼠IBD的治疗效果

为了评估ECN-pE(C/A)2在DSS诱导的IBD小鼠中的治疗效果。首先在C57BL/6小鼠中成功构建IBD模型(图3)。ECN-pE(C/A) 2处理明显保护小鼠免受DSS诱导的IBD，包括体重减轻、结肠长度缩短和结肠组织损伤。为了进一步评估ECN-pE(C/A)2的治疗效果，对结肠进行了组织学评估。图3g-h所示，用ECN-pE(C/A)2处理的小鼠结肠表现出较低的组织病理学评分，接近对照组(PBS+水)。且通过ELISA测量测得ECN-pE(C/A)2处理的小鼠中促炎细胞因子的水平明显下降，而抗炎细胞因子的水平显着上调，进一步证明了ECN-pE(C/A)2具有出色的抗炎作用(图3-m、n)。综上所述，壳聚糖/海藻酸钠包覆具有CAT和SOD表达的ECN-pE用ECN-pE(C/A)2处理的小鼠结肠表现出较低的组织病理学评分、使抗炎细胞因子的水平上调，可有效缓解DSS诱导的急性IBD。

图4 ECN-pE(C/A)2对结肠上皮细胞的修复作用及体内安全性评价

进一步研究ECN-pE(C/A)2对结肠上皮细胞和受损结肠上皮屏障的影响，这是DSS诱导的急性IBD的关键特征。根据免疫荧光染色结果(图4-a、b、d、e)，与ECN-pE和ECN(C/A)2处理相比，ECN-pE(C/A)2治疗有效上调结肠组织中ZO-1和Occludin的表达，这进一步表明抗氧化酶(CAT和SOD)和壳聚糖/海藻酸钠涂层在结肠上皮修复中的关键作用。进行了FITC-葡聚糖灌注试验以评估结肠通透性，表明DSS诱导的结肠炎小鼠肠道屏障得到了恢复(图3-f)。如图4-c和4-f所示，ECN-pE(C/A)2治疗显着减轻了结肠上皮细胞的凋亡水平，与健康小鼠非常接近。

4. ECN-pE(C/A) 2的生物安全性评价

图4 ECN-pE(C/A)2对结肠上皮细胞的修复作用及体内安全性评价

随后确定了ECN-pE(C/A)2的生物安全性。在该实验中，多次口服ECN-pE(C/A)2后第10天进行血清生化测定和全血组测试(图4-g)。喂食了ECN-pE(C/A)2的小鼠血细胞参数与健康小鼠指标一致。肝肾功能参数也在正常范围内。此外，小鼠的主要器官的重量和组织切片几乎没有差异。综上结果表明ECN-pE(C/A)2没有引起任何不良副作用。

5. ECN-pE(C/A) 2对肠道微生物组的调节作用

图5 ECN-pE(C/A)2在IBD治疗期间调节肠道菌群

肠道微生物组已被证明是肠道炎症发展过程中的一个重要因素。为了探索肠道微生物组在治疗过程中的作用，作者研究了ECN-pE(C/A)2在用抗生素预处理的小鼠中DSS诱导的急性IBD中的治疗效果以及模型中肠道微生物群的丰度。然后，进行16S rRNA基因测序测定肠道菌群的丰度，结果表明，口服ECN-pE(C/A)2可以显着改变DSS处理的肠道菌群的丰度和多样性。结果证实ECN-pE(C/A)2可以调节健康和DSS诱导的IBD小鼠的肠道微生物组。此外，16S rRNA结果显示ECN(C/A)2对DSS处理小鼠肠道菌群的调节作用不大，而ECN-pE(C/A)2的肠道菌群调节作用与过氧化氢酶/超氧化物歧化酶的表达相关。

6. ECN-pE(C/A) 2对延迟治疗IBD的疗效

图6 ECN-pE(C/A)2延迟治疗对 DSS 诱导的鼠 IBD 的治疗效果

进一步探讨ECN-pE(C/A)2对延迟治疗IBD的治疗效果，结果证实ECN-pE(C/A)2可以显着缓解DSS诱导的急性IBD。

结论

研究者开发了一种工程益生菌，能够在胃肠道内原位产生CAT和SOD，并验证了其在清除ROS方面的出色效率。考虑到复杂的胃肠道环境通常会导致益生菌的死亡，研究者使用了壳聚糖和海藻酸钠进行微胶囊化，以有效地口服递送工程益生菌。实验结果证实，外层的海藻酸盐涂层可以收缩并产生皮肤状结构以阻断酸和胆汁盐，壳聚糖/海藻酸钠涂层的益生菌表现出非凡的胃肠道耐受性并显着提高了口服生物利用性。口服具有生物膜自涂层的基因工程益生菌可以有效调节炎症和肠道微生物群，从而缓解小鼠模型中的急性结肠炎。鉴于肠道微生物群失调和炎症反应是许多疾病的类似症状，益生菌的基因工程与功能性表面涂层相结合技术可能为治疗该类疾病提供一个方便并有前景的平台。

参考文献：

Zhou, J., Li, M., Chen, Q. et al. Programmable probiotics modulate inflammation and gut microbiota for inflammatory bowel disease treatment after effective oral delivery. Nat Commun 13, 3432 (2022).https://doi.org/10.1038/s41467-022-31171-0.