核心提示：外源性RNA包装的RNA噬菌体病毒样颗粒(VLPs)作为工作流程控制和感染性病毒颗粒的替代品，已被用于临床诊断。

  质粒、DNA或体外转录RNA常被用于验证新的诊断工作流程，然而，它们不能很好地代表临床样本。外源性RNA包装的RNA噬菌体病毒样颗粒(VLPs)作为工作流程控制和感染性病毒颗粒的替代品，已被用于临床诊断。为了创造更稳定的DNA病毒颗粒替代品，Emesvirus zinderi (MS2) RNA噬菌体系统已经成功地用于外源DNA的包装，但该过程昂贵且复杂，使其不太可能被广泛采用。

  GEN biotechnology杂志发表题为“Simple Low-Cost Production of DNA MS2 Virus-Like Particles As Molecular Diagnostic Controls”的文章，在这项研究中，提出了一种简单、廉价的方法来生产用DNA包装的MS2 VLPs，该方法利用亲和层析纯化和酶促生产适合包装的外源DNA。所产生的VLPs用乙型肝炎病毒DNA包装，然后使用液滴数字PCR进行定量，并在经认可的临床实验室中使用商业检测方法根据世界卫生组织国际标准进行校准。

  图1 点击化学技术与酶切法制备双链DNA的比较

  对于点击化学方法，巯基修饰的引物用于执行初始PCR，这些引物与含有具有胺修饰的pac位点的寡核苷酸结合。对于T7外切酶酶切，引物通过在受保护的寡核苷酸的前五个碱基上添加硫代磷酸键进行化学修饰。这些键的加入保护链不被消化，因此最终产物包含了受保护的寡核苷酸(正选择)。相反，对于λ外切酶酶切，引物通过磷酸化进行化学修饰。然后，λ外切酶优先消化已磷酸化的链，留下不含磷酸化寡核苷酸的最终产物(负选择)。

  图2 DNA MS2 VLPs的制备及生化表征

  (a)通过空颗粒蛋白纯化制备DNA VLPs，然后拆卸，与外源DNA组装，最后第二次亲和层析步骤分离包装的DNA VLPs。(b)初始亲和层析的SDS-PAGE凝胶电泳包括一个蛋白质标记(M)，然后是细胞裂解物的颗粒(P)和可溶性部分(S)，然后是柱FT和收集的洗脱部分，其中外壳蛋白二聚体(*28 kDa)用箭头表示。(c) MS2 DNA VLPs的动态光散射分析，显示主要是*30 nm的单分散种群。误差条表示三个技术重复的标准差。(d)凝胶移位实验显示VLPs内的upDNA和pDNA并排运行。pDNA，包装DNA;SD:标准差;SDS-PAGE，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳; upDNA，未包装的DNA;VLPs，病毒样粒子。

  最后，通过将生成的颗粒掺入人血浆并使用商用诊断HBV qPCR来验证它们。MS2 VLPs制剂在加入血浆时是稳定的，四个生物重复中显示结果一致。

  图3 使用罗氏cobas 6800系统和罗氏cobas HBV检测，根据HBV国际标准校准生产的VLPs标准。

  参考文献：

  Crone M A, Freemont P S. Simple Low-Cost Production of DNA MS2 Virus-Like Particles As Molecular Diagnostic Controls[J]. GEN biotechnology, 2022, 1(6): 496-503.