核心提示:为了探究原噬菌体是否参与了病原菌之间的竞争,构建了猪全层热损伤创伤模型并接种了多株铜绿假单胞菌,筛选出具有竞争优势的病原体进行检测分析。
有研究指出原噬菌体可能也参与了细菌间的竞争,协助细菌持续感染宿主。为了探究原噬菌体是否参与了病原菌之间的竞争,构建了猪全层热损伤创伤模型并接种了多株铜绿假单胞菌,筛选出具有竞争优势的病原体进行检测分析。
研究构建了猪全层热损伤创伤模型后,共接种了6个不同的铜绿假单胞菌菌株。结果表明PA14和PAO1为优势种。从菌落形态的差异来筛选感染过程中发生的进化变异,发现主要的新表型是皱褶小菌落变体(RSCV),其特点是具有更高的生物菌膜水平,能使病原菌抵御抗生素和宿主免疫。对分离的RSCVs和非RSCVs细菌进行测序,结果显示,PA14基因组中与cyclic di-GMP和生物膜生成相关的基因wsp操纵子发生了高频率的突变。与原始菌株相比,大部分PAO1 RSCV伴随着高cyclic di-GMP表达和更多的生物菌膜,而无RSCVs表型的突变株则没有这些特征(图1)。
图1 从猪烧伤创面分离的PAO1 RSCVs具有高生物膜表型
进一步对测序结果进行分析发现,从猪伤口中分离出的RSCV和非RSCV的大部分PAO1菌株的基因组都包含了7到70 kb的外源DNA片段。这些外源DNA片段主要来自于原噬菌体的遗传物质。据此推测原噬菌体在感染早期就被激活并将遗传物质重组到PAO1的基因组里,之后通过基因水平转移插入到其他菌株。
为进一步证实是原噬菌体的插入使细菌获得了RSCV表型,将野生型dipA或retS等基因转入到RSCV细菌中。结果显示转入了野生型基因后,其RSCV形态特征消失。表明原噬菌体的插入使dipA、retS等基因被破坏,导致RSCV表型的出现。(图2)
图2 噬菌体破坏cyclic di-GMP相关基因导致PAO1获得 RSCV表型
比较噬菌体对RSCV和非RSCV细菌的生长抑制情况表明,插入了原噬菌体并具有RSCV表型的细菌获得了免疫噬菌体的能力,而非RSCV细菌的生长则会被抑制。(图3)
图3 PAO1 RSCV分离株对噬菌体感染具有免疫作用
为探究原噬菌体插入的新基因对细菌适应能力的影响,分别构建了带有retS基因突变,具有RSCV表型的菌株PAO1retS::Tn ,和原噬菌体插入retS基因但无RSCV表型的菌株RSCV-5 p-retS,比较哪种菌株的适应力更强。结果显示,PAO1retS::Tn仅能适应生物膜环境,而RSCV-5 p-retS可适应浮游和生物膜两种生存条件(图4)。
图4 PAO1 RSCVs相对于原始菌株PAO1具有更高的适应性
上述研究表明,原噬菌体插入到细菌基因组后能让其获得进化优势,使细菌抵御抗生素和宿主免疫,增强细菌对宿主的适应能力,且其他细菌有机会通过基因水平转移获得这种适应力。细菌的这种由原噬菌体介导的抗性获得机制可能是其出现耐药性突变的主要原因。
总结:
以往对细菌测序结果进行分析时,通常先与细菌的参考基因组进行比对来判定来自细菌基因组的遗传信息,而被判定为污染的序列则被剔除,但这些序列中可能有很多是通过基因水平转移到细菌基因组内的有效信息。
通常认为,病原菌主要通过随机的点突变获得耐药性,然而该研究表明原噬菌体插入可能才是病原菌产生耐药性突变的主要原因,这为研究病原菌在宿主中的慢性感染与药物治疗提供了新思路。