核心提示：HEPT被视为一种精确的抗菌剂，它结合了噬菌体固有的、病原体特异性的杀伤活性，以及原位产生和释放次生抗菌效应物的特征，这种局部的双管齐下的方法增强了噬菌体的抗菌活性，能够抑制噬菌体耐药亚群的生长，并且可以利用单一HEPT或HEPT鸡尾酒来提供细菌病原体的跨属控制。
最近，瑞士苏黎世联邦理工学院食品营养与健康研究所Matthew Dunne和 Samuel Kilcher团队在《自然 通讯》发表题为Enhancing bacteriophage therapeutics through in situ production and release of heterologous antimicrobial effectors 的研究论文，该研究通过五种不同且严格烈性的噬菌体来设计异源效应噬菌体治疗 (HEPTs) (图1)。
HEPTs的噬菌体主要针对尿路感染病原体大肠杆菌 (噬菌体E2和CM001)，粪肠杆菌 (噬菌体EfS3和EfS7) 和肺炎克雷伯菌 (噬菌体K1)。五种噬菌体代表不同的系统发育家族，具有不同的病毒粒子形态和基因组大小。为了靶向革兰氏阴性尿路感染病原体，研究人员选择了四种大肠杆菌素样的细菌素 (CLBs) 作为效应剂，它们对大肠杆菌 (colicins E6、M和E7;绿色) 或肺炎克雷比菌 (klebicin M;紫色) 均有效果。为了针对革兰氏阳性尿路病原体粪肠球菌，研究人员同时采用了噬菌体衍生的工程细胞壁水解酶 (EC300;蓝色)，对识别和降解粪肠杆菌细胞壁具有很高的特异性。EC300是通过将粪肠杆菌噬菌体内溶酶细胞壁结合域与病毒粒子相关溶酶的M23内肽酶结构域融合而成的。
所有效应基因都经过密码子优化，以匹配靶标细菌的特异性，这些效应基因与一个强核糖体结合位点一起整合在噬菌体结构基因盒中，以指导晚期启动子驱动的表达 (图1c-f)。利用CRISPR-cas9辅助工程技术或在合适的替代宿主中启动合成基因组，构建工程的HEPT候选基因。利用野生型 (WT)噬菌体或HEPT裂解物对选定的临床目标菌株进行现场检测，证实了工程噬菌体感染后产生的活性效应蛋白 (图1d-f)。裂解活性试验结果表明，klebicin M和EC300编码的HEPT分别靶向54%和92%的测试分离株;此外，在这三种大肠杆菌素中，E7表现出最广泛的活性，HEPT EfS3::colE7对56株泌尿系大肠杆菌有70%的裂解能力。
图1：HEPTs的构建和有效载荷活性评估
因此，研究人员评估了HEPTs通过酶附带损伤 (cross-targeting HEPTs，图2a) 将具有交叉属活性的效应物传递给由不同临床分离物组合组成的多微生物群落的能力。全部交叉HEPT在共培养感染实验中进行测试，如图2b所示。通过浊度降低和时间杀伤试验结合不同浓度平板试验，作者证明了HEPTs的EfS3::colE7和EfS7::colE7能感染并杀死粪肠杆菌细胞(P，产生者)，同时通过原位释放colicin E7效应物在两小时内根除共培养的大肠杆菌(R，受体)(图2c, d)。同样，研究人员也证明了产生klebicin M-的HEPT EfS3::kvarM和Efs7::kvarM能成功控制粪肠球菌 (P)和肺炎克雷伯菌 (R) (图2e, f);这表明CLB效应物提供了一种可行的跨属靶向细菌策略。如图2g, h所示，研究证明了基于大肠杆菌噬菌体CM001的产生ec300的HEPT的能力在共培养中靶向粪肠杆菌，结果表明，在大肠杆菌Ec20 (P)和粪肠杆菌Ef12(R)共培养6小时后，粪肠杆菌细胞计数减少了约4 log(图2 h)。然而，在较长时间内持续观察到耐药菌的再生，其中一些在短至10小时内反弹至饱和，强调需要采取额外措施来对抗细菌耐药性(图2c-h)。
图2：交叉靶向HEPTs控制尿路感染多种微生物病原菌群落
为了绕过细菌耐药性的限制，HEPT被设计成通过噬菌体介导的CLB递送来靶向耐药亚群，clb提供了一种针对相同目标物种的正交杀伤机制 (自靶向HEPT，图3a)。为此，研究人员构造HEPTs E2::colE7和K1::kvarM (图3b)用于处理大肠杆菌或单培养克雷伯菌，并将其性能与WT噬菌体进行比较。结果表明，在感染后10小时强烈减少克雷伯氏菌细胞计数，并在18小时时延迟克雷伯氏菌细胞的再生 (图3d)。为了在UTI的背景下测试这种方法，该研究评估了野生型和HEPT鸡尾酒对合成尿中大肠杆菌/肺炎克雷伯菌共培养物的抑菌活性(图3e, f)。使用两种自靶向HEPT (E2::colE7和K1::kvarM) 的组合，本研究能够证明在共培养中对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的杀伤能力有很强的增强 (图3e)。此外，类似于双重自靶向HEPT的使用，两种交叉靶向HEPT的组合(E2::kvarM和K1::colE7)在共培养中也导致了大肠杆菌和克雷伯氏菌杀灭效果的类似改善 (图3f)。总的来说,HEPTs为目标细菌提供了有效的、局部的和双重的作用效果，并通过产生自靶向或交叉靶向效应物来防止或延迟它们的再生。
图3：自我靶向的HEPT通过释放大肠杆菌素样细菌素增强对尿路致病性大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的杀伤。
在未来，基于噬菌体的精准抗菌剂可能会被设计和实施为个性化的治疗选择。因此，快速可靠的伴随诊断将有助于指导噬菌体选择和/或预测治疗成功。为了评估自我靶向HEPT对患者尿液中大肠杆菌的性能，我们将最近开发的基于报告噬菌体的诊断方法与HEPT E2::colE7的体外尿液治疗相结合 (工作流程:图4a)。
39份尿液样本中有8份大肠杆菌培养阳性，其中7份通过E2::nluc检测到 (图4b和补充图3a，尿液分析)。标本#5因存在>107 CFU/mL肺炎克雷伯菌而被排除(仅在系列浓度琼脂上涂布16小时后检测到)。其余6株患者分离株根据其敏感性可分为三类:(I)噬菌体和大肠杆菌素敏感，(II)噬菌体耐药但大肠杆菌素敏感，(III)噬菌体敏感但大肠杆菌素耐药。总的来说，离体研究表明，如果分离物对噬菌体和效应物(即colicin E7)都敏感，则HEPT介导的对新鲜患者尿液中的大肠杆菌的杀伤增强。
图4：HEPT增强了患者尿路对大肠杆菌素敏感大肠杆菌的杀伤能力
总之，HEPT被视为一种精确的抗菌剂，它结合了噬菌体固有的、病原体特异性的杀伤活性，以及原位产生和释放次生抗菌效应物的特征，这种局部的双管齐下的方法增强了噬菌体的抗菌活性，能够抑制噬菌体耐药亚群的生长，并且可以利用单一HEPT或HEPT鸡尾酒来提供细菌病原体的跨属控制。此外，噬菌体支架和效应物文库的不断增加，加上基因组编辑、功能筛选和分析技术的进步，为建立一个设计-构建-测试-学习平台提供了可能性，以快速定制符合患者个体需求的HEPT。这种个性化的治疗方法，以及基于报告噬菌体的伴随诊断，不仅对尿路感染，而且对其他传染病都有很大的希望。
