肠道微生物群和转录组学揭示了人类诺如病毒生物蓄积对牡蛎的影响
原创 发布时间:2022-09-01 浏览次数: 1514 来源: 蔡伟程

核心提示:人诺如病毒(Human norovirus,HuNoV)是引起急性病毒性肠胃炎的主要食源性病原体,它能够与组织血型抗原(HBGAs)发生特异性结合,是HuNoV的靶向受体。HBGAs是一种复杂的碳质抗原,主要存在于细胞表面,而由于牡蛎体内存在这种HBGAs,当牡蛎滤食过程中,它们的消化腺会积累HuNoV,是其传播的主要载体之一。


  人诺如病毒(Human norovirus,HuNoV)是引起急性病毒性肠胃炎的主要食源性病原体,它能够与组织血型抗原(HBGAs)发生特异性结合,是HuNoV的靶向受体。

  HBGAs是一种复杂的碳质抗原,主要存在于细胞表面,而由于牡蛎体内存在这种HBGAs,当牡蛎滤食过程中,它们的消化腺会积累HuNoV,是其传播的主要载体之一。

  在2020年法国发生的一场与牡蛎相关的huNoV流感疫情中,有1033人出现症状,21人需要住院,并且在欧洲,诺如病毒保持较高的流行率。

  此外,HBGAs样分子也可以被肠道细菌表达,如革兰氏阴性肠杆菌科。鼠源诺如病毒 (MuNoV)可以不同程度地直接结合某些细菌,包括阴沟肠杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜酸乳杆菌、加氏乳杆菌和多雷拟杆菌。

  虽然在了解牡蛎生物积累的HuNoV模式方面已经取得了进展,但牡蛎对HuNoV生物积累的反应,包括基因表达和肠道菌群的变化,尚不清楚。

  本文研究了牡蛎HuNoV生物积累过程中HBGAs样分子表达和基因调控特征,以及HuNoV与微生物组的相互作用。这项研究为 HuNoV 生物蓄积对牡蛎的影响提供了重要的新见解,包括肠道微生物群结构、反应和基因调控特征。

  牡蛎消化组织中HuNoV的生物积累和HBGAs样分子的表达

  在含GI0.5 HuNoV的海水中饲养牡蛎,研究HuNoV在牡蛎消化组织中的生物积累。如图1A所示,在生物积累的前6 h,HuNoV在牡蛎的消化组织中迅速积累,24 h后趋于平缓并趋于稳定。这说明在生物积累24 h时,实验浓度下的GI0.5 HuNoV牡蛎可以完全积累。

  有研究表明HBGAs属于糖鞘脂类(glycosphingolipids,GSLs),主要存在于胃肠道的上皮细胞中。至少有7种不同的HBGAs (A型、B型、H1型、Lewis A、Lewis x、Lewis B和Lewis y)可以与HuNoV结合。

  如图1B所示,牡蛎消化组织中A型HBGAs样分子的P/N比随着HuNoV生物积累时间的延长而增加。H1和Ley HBGAs样分子在HuNoV生物积累48 h时明显升高,而其他HBGAs样分子表达水平没有明显变化。结果表明,HuNoV的生物积累促进了一些HBGAs样分子的表达。


  图1牡蛎消化组织中HuNoV含量(A)和HBGAs样分子表达(B)随HuNoV生物积累时间的变化。

  牡蛎微生物群对HuNoV生物积累的响应

  牡蛎消化组织中的优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),这与之前对几种牡蛎物种的研究一致。其中Proteobacteria在双壳类动物的胃肠道中具有固氮作用,还能降解食物中的纤维素和琼脂。

  HuNoV的生物积累可降低牡蛎肠道菌群的丰度并改变其组成。特别是随着生物积累时间的延长,布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的丰度降低,而弧菌属的丰度增加。

  研究表明,布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)可以增加短链脂肪酸(SCFAs)的产生,并表现出免疫调节和抗致病性作用。


  图2随着HuNoV生物积累,牡蛎消化组织肠道菌群组成的变化(A)不同肠道菌群的维恩图。与C24h组相比,D24h组的肠道菌群丰度显著降低。(B)基于unweighted UniFrac距离的PCoA图。对照组、C6h组和C24h组聚在PC1轴上,与HuNoV处理组分离。(C)门水平微生物群落结构。随着生物积累时间的延长,厚壁菌门丰度降低,变形菌门丰度增加。(D)各组前25个属的热图。HuNoV生物积累显著降低了Blautia, Agathobacter, Bifidobacterium,Lactobacillus, Ruminococcus, Faecalibacterium, and Terrisporobacter的丰度,增加了Vibrio和Alphaproteobacteria的丰度,且随着生物积累时间的延长,丰度变化更为显著。

  线性判别分析效应量 (LEfSe) (LDA > 3.5)分析揭示了各组中OTU水平差异较大的类群,以确定不同HuNoV生物积累时间的特异性表型差异。

  通过5组的比较,确定了42种类型作为分离肠道菌群的高维生物标志物。其中,对照组、D6h、C24h和D24h组分别富集了32、6、3和1种系统类型(图3)。

  其中,毛螺菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、布劳特氏菌属(Blautia)、阿加杆菌属(Agathobacter)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、乳酸菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)和孢子杆菌属(Terrisporobacter)的丰度在对照组中较高; 假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、红链假单胞菌(Rubritalea)、科尔韦尔氏菌属(Colwellia)、沉积物粉色海生菌(Roseimatinus)和芽单胞菌科(Gemmatimonadaceae)分别在D6h和D24h较高。


  图3 LEfSe决定了5组肠道菌群系统类型显著差异的丰度。每个分类单元的线性判别分析(LDA)得分(log 10)用横杠表示,红色、蓝色、绿色、黄色和紫色的横杠分别表示对照、C6h、D6h、C24h和D24h研究对象的微生物群落富集的分类单元。

  HuNoV生物蓄积对牡蛎影响的转录组学分析

  采用主成分分析(PCA)对7组的转录本进行比较,HuNoV处理组与对照组和阴性对照组分离良好(图4A)。

  差异表达基因(DEG)分析结果表明,HuNoV可以改变牡蛎消化组织中DEGs的数量,随着HuNoV生物积累时间的延长,DEGs的数量增加(图4B)。


  图4 HuNoV对牡蛎生物积累影响的转录组学分析。(A) PCA评分图。D24h和D48h组与对照组和阴性对照组在PC1轴上分离良好。(B)组间基因表达差异。与阴性对照组相比,D6h、D24h和D48h组分别有72个(上调33个,下调39个)、190个(上调85个,下调105个)和259个(上调124个,下调135个)DEGs。

  利用基因本体论(GO)生物信息学资源进一步分析阴性对照组和HuNoV处理组之间的DEGs。将DEGs映射到KEGG数据库中的参考通路,以确定牡蛎消化组织中活性的生物通路(图5)。


  图5 HuNoV影响的DEGs的KEGG富集分析(Padjust<0.7,top 10 in enrichment degree)。富集因子越大,KEGG通路富集越显著。

  采用qRT-PCR (quantitative real- time PCR,quantitative real- time PCR)检测6个具有代表性的不同fold change的DEGs,以确认转录组分析结果的准确性。结果显示,qRT-PCR验证的基因表达趋势与转录组测序(RNA-seq)分析结果一致(图6)。


  图6与RNA-seq比较,qRT-PCR验证6个基因的相对表达量。(A) C6h与D6h;(B) C48h对比D48h。

  研究结论

  HuNoV污染的牡蛎是急性病毒性肠胃炎暴发的主要原因之一。由于HuNoV与HBGAs样分子的结合特性,即使不能在牡蛎中复制HuNoV,牡蛎也能持续积累HuNoV。特别是某些HBGAs样分子的表达随着HuNoV生物积累时间的延长而增加(图2B)。。

  牡蛎消化组织中的优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes),这与之前对几种牡蛎物种的研究一致。

  HuNoV的生物积累可降低牡蛎肠道菌群的丰度并改变其组成。特别是随着生物积累时间的延长,布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)的丰度降低,而弧菌属Vibrio的丰度增加。

  研究表明,布劳特氏菌属(Blautia)、粪杆菌属(Faecalibacterium)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)可以增加短链脂肪酸(SCFAs)的产生,并表现出免疫调节和抗致病性作用。

  双歧杆菌属、乳杆菌属等益生菌通过竞争消灭病原微生物或产生抑菌物质参与宿主的免疫防御。一般来说,弧菌属主要存在于疾病敏感的牡蛎中,不主导健康牡蛎的微生物区系。由此可见,HuNoV可能会降低牡蛎的免疫力,增加牡蛎患病的几率。

  免疫相关基因表达的变化揭示了牡蛎对HuNoV的反应。巨噬细胞甘露糖受体1 (macrophage mannose receptor 1,MMR1)作为一种重要的吞噬细胞受体,介导甘露糖残基的结合。HuNoV生物积累过程中MMR1的上调提示HuNoV可增强血细胞吞噬功能。

  先前的研究表明,透明蛋白可以通过识别非自身抗原聚糖(在弧菌感染期间存在于蛤蜊中)来触发免疫反应。这与在本研究中观察到的HuNoV治疗组中perlucin上调是一致的。Toll样受体3 (TLR3)可以识别病毒RNA。髓样分化初级反应蛋白88 (myeloid differentiation primary response protein 88,MyD88)作为一种细胞质适配器蛋白,在TLR信号通路中发挥重要作用。MyD88在D24h和D48h组上调,表明HuNoV的生物积累激活了TLR通路。

  此外,热休克蛋白(HSPs)是一种内源性配体,在应激条件下会大量触发。据报道,热休克蛋白对蛤蜊和缢蛏的弧菌感染有反应。在本研究中,HSPs在HuNoV生物积累牡蛎中得到高表达。最近的一项研究表明,HSP70是牡蛎组织中HuNoV特异性结合的重要候选配体。作为免疫效应物,补体系统基因、相关细胞因子和溶菌酶在HuNoV处理组中上调(表1),这些基因在其他HuNoV生物积累双壳类动物中也上调。

  本研究为阐明 HuNoV 生物蓄积对牡蛎的影响提供了证据。 HuNoV 改变了HBGAs 样分子和免疫和糖鞘脂生物合成相关基因的表达。 提供了一些关于牡蛎肠道微生物群及其对 HuNoV 生物累积反应的初步数据。

  值得注意的是,HuNoV 的生物蓄积显着改变了牡蛎的肠道微生物群组成,益生菌减少和病原体随着生物蓄积时间的延长而增加就证明了这一点。然而,有益微生物群在 HuNoV 对牡蛎的生物累积影响中的作用和机制值得进一步研究。 此外,改变牡蛎肠道微生物群和基因表达的 HuNoV 生物蓄积量也需要进一步探索。

  参考文献

  Yang M, Tong L, Wang S, et al. Gut Microbiota and Transcriptomics Reveal the Effect of Human Norovirus Bioaccumulation on Oysters (Crassostrea gigas)[J]. Microbiology Spectrum, 2022: e00161-22.

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