噬菌体T7辅助进化核糖开关

2023-02-10 00:00:00
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核心提示:噬菌体可以通过发展基于条件基因互补的选择系统来加速蛋白质的进化。由于噬菌体可以容忍突变负荷,因此具有很高的进化速度。

  噬菌体可以通过发展基于条件基因互补的选择系统来加速蛋白质的进化。由于噬菌体可以容忍突变负荷,因此具有很高的进化速度。也有可能通过设计双重选择系统(正负筛选)来进化基因开关。到目前为止,只有噬菌体M13被用于这一目的,但细菌在感染后不会死亡,会分泌未进化的噬菌体,所以初始阶段这些噬菌体会占大部分。

  近期,来自西班牙瓦伦西亚理工大学的Alfonso Jaramillo等人在bioRxiv发表题为“Accelerated evolution using the phage T7 and its application to evolve riboswitches”的论文,用烈性噬菌体T7构建了进化系统,称为T7AE。T7噬菌体的DNA聚合酶(由gp5编码)具有易错突变体,可以加速突变速率。作者设计了正向和负向筛选:正向筛选环节,在T7噬菌体引入T7启动子+随机化的茶碱核糖开关+cI转录因子+噬菌体复制必须基因trxA(作为克隆筛选marker),敲除gp5;在正筛选宿主BW25113敲除cmk,引入T7 gp5。当被茶碱激活时,cI会激活PRM启动子表达噬菌体复制必需基因cmk,从而使经过改造的噬菌体才能侵染宿主并复制存活,并可以通过茶碱的浓度控制突变速率。在负筛选环节,作者用另一株携带PRM启动子表达pifA基因(会产生顿挫感染)质粒的大肠杆菌作为负筛选宿主(含有一拷贝cmk基因),不给予茶碱,因此能感染负筛选宿主的噬菌体包含的突变应该都是不想要的,这样可以筛选掉负突变,从而使具有正突变的噬菌体继续感染正筛选宿主。

  在第一个感染周期幸存下来的噬菌体已经表现出偏好第八个核苷酸为G。到第6周期,有一个序列在种群中被删选出来,最终保持主导地位(TTGCATCG,或稍微改进的TTGCATCA)。

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