摘要：病毒是微生物群落发展进化的重要驱动力，影响微生物的死亡率、代谢和基因水平转移。然而，在许多环境中，包括在饮用水系统中，病毒的危害仍是未知的。在这项研究中，我们从全球六个国家的公共饮用水分配系统中挖掘与饮用水相关的病毒DNA序列来弥补这一空白。这些数据集概述了全球饮用水病毒组的分类多样性和代谢潜力，并为研究地理、气候和饮用水处理方法对病毒多样性的影响提供了数据基础。我们发现，环境条件和样品处理的差异都会影响水样中的病毒组成。在配水系统中，余氯与病毒多样性和代谢潜力的有着密切联系，与在没有余氯的分配系统中观察到的相比，病毒种群显著减少，病毒群落结构也更简单。此外，饮用水病毒携带抗生素抗性基因(ARGs)，以及在氧化应激和氮限制下能够存活的基因。我们的发现为下一步研究提供了方向，以便更深入地了解饮用水分配系统中病毒与细菌间的相互作用以及他们如何影响水质。

  引言

  宏基因组学研究已成为评估饮用水微生物群对水质累积影响的关键。从水源水到处理后的水，许多因素都会影响饮用水中微生物群落的组成与结构。目前已有的研究成果最多也只是量化了细胞宏基因组中病毒序列的比例，关于饮用水中病毒的基本信息，如它们的分类和代谢多样性，以及对饮用水微生物群落的影响，仍然未知。为了弥补这一领域的知识空白，对DNA病毒的宏基因组进行了重新检查，揭示病毒多样性，进一步解释病毒与宿主相互作用机制。这项工作的总体目标是描述饮用水分配系统中的病毒群落。为此，我们从公开可用的宏基因组数据集中提取世界各地饮用水分配系统数据来鉴定病毒基因序列，以评估病毒的多样性和代谢潜力。之后，我们进一步调查了研究方法和环境条件对病毒群落结构的影响。

  结果

  饮用水系统中的病毒生态学

  我们收集了公开的饮用水的宏基因组数据，整合来自同一饮用水分配系统的所有样品(表S1和S4)，产生了729724个分子量大于3kb的重叠群，挖掘鉴定出62500个病毒序列，占所有长度超过3kb重叠群的9%。我们的结果与海洋宏基因组研究中观察到的病毒序

  列百分比上限(0.3–16%)一致，且病毒基因组材料代表大约10%的生物群体DNA。

  在62500个病毒序列中，23573个(37%)形成了近似属级相关性的7897个病毒簇(图1A;表S3)。根据国际病毒分类委员会(ICTV)规定，只有778个病毒簇(所有病毒簇的10%)被vConTACT2给予了明确的分类(表S4)。其中778个病毒簇中的763个，属于尾状双链DNA噬菌体的尾状病毒目家族。Podoviridae(373 VP)、Siphoviridae(284)和Myoviridae是这些样本中三个最常见的病毒家族，也是许多其他淡水环境中的三个主要家族。

  图1 饮用水病毒群(VPs)的概述。(A)根据vConTACT2对饮用水中的病毒分类 (B)超过10%的样本与vConTACT2的病毒参考基因组存在着联系。(C)样本VP值(大于1%的读数)与该病毒群的样本数量。图中仅包括样本中相对丰度大于1%的病毒群落。

  在我们的研究结果中，只有1%的饮用水病毒种群能够被病毒分类学命名(图2A)。在所有分布系统中确定的48935个VP(95%ANI，85%重叠群)中，超过10%的样本中发现了156个病毒群。其中8个具有一级分类分配：7个属于尾状病毒目，一个属于微病毒科(图1B)。三种最普遍的病毒群是VP_905、VP_ 2791和VP_1288(图1C)，其中42%的样本中发现了最常见的VP_2791。VP_905和VP_2791 被归类为 Siphoviridae 家族 (Caudovirales) 中的未知属，VP_1288暂时没有分类。VP_905和VP_ 2971与绿芽藻的序列最相似(图2A，表S5)，VP_ 905也与红杆菌LPB0142(图2A)相类似，VP_1288与亚硝酸盐氧化细菌winogradskyi最为相似(图2B)。

  图 2 三种全球最普遍的饮用水病毒群(VP)与已知序列(NCBI nt)的基因组比较。(A) VP_905(55.2kb)与红杆菌LPB0142的比较，VP_ 905和VP_ 2971(35.0kb)与绿芽孢杆菌的比较;(B)VP_ 1288(46.8kb)与硝化杆菌的比较。

  环境条件和实验设计对饮用水病毒群落的影响

  评估实验设计和环境条件对病毒群落结构的可能影响。样本所在大陆、气候区以及DNA提取方法的不同，对病毒群落结构产生了显著的影响(PERMANOVA;表S7)。水源、分配系统水质以及一些原始宏基因组学研究中未明确报告的条件，也会对病毒结构产生显著性影响(PERMANOVA R2=0.21，p值=0.0001)。此外，我们对Dai(2020)和Sevillano(2021)等人从多国采集的样本研究发现，氯是微生物群落组成差异的主要决定因素。病毒组β-多样性与氨、磷酸盐和硝酸盐浓度、DO、电导率、水温、pH和TOC相关(图3;表S8和S9)。这些结果表明，水质参数能够影响饮用水的病毒群落。

  消毒剂对饮用水病毒宿主及病毒群落结构的影响

  我们研究发现，与不使用消毒剂的配送系统相比，使用消除剂的饮用水系统的病毒群落多样性较低。这种现象也存在于同时使用氯和氯胺的系统，以及使用其他消毒剂的样本(Tukey试验padj≤ 10−6.表S5)。Sevillano(2021)研究GUA的样本，其氯浓度低于限值或远低于其他地点检测值(氯浓度<0.05 mg/L)。与其他样品(PERMANOVA R2=0.18，p值=0.0002;图3B)相比，包括具有相似电导率、温度和其他水质参数的样品，GUA样品的病毒群落结构不同。这些结果表明，使用残留消毒剂系统的病毒群多样性和病群落较少。

  图3 基于残留消毒剂使用和水质与病毒群多样性聚类。(A)Dai等人(2020)的样本中多种因素与病毒群落结构的关系，(B)Sevillano等人(2021)的样本中多种因素与病毒群落结构。

  病毒群落的代谢潜力与水质参数的差异相关

  病毒群落代谢潜力随水质参数的变化而变化，所有测试水质参数与使用残留消毒剂的系统的样本的代谢谱相关(图5;PERMANOVA表S11)。与没有残留消毒剂的饮用水分配系统中病毒种群的多样性不同，使用残留消毒剂饮用水分配系统中病毒宿主的代谢潜力更高(Wilcoxon秩和检验p值=0.03;表S6)。KO代谢途径模块在使用残留消毒剂和未使用的饮用水分配系统之间的相对丰度也不同(图5B，表S12)。不使用残留消毒剂的分配系统的病毒群富含具有核苷酸代谢基因，使用残留消毒剂的分配系统的病毒群富含涉及辅助因子、维生素代谢以及生物降解和代谢的基因。以上表明，携带额外调控基因能帮助病毒在残留消毒剂存在的氧化应激环境中存活。无残留消毒剂系统中核苷酸代谢增多，潜在原因可能是因为样本中的微生物多样性增加(图4)。

  图4 病毒多样性因样本是否来自使用或不使用残留消毒剂的分配系统而异。(A) 观察每个样本病毒群落的标准化病毒丰富度;(B) Shannon均匀度指数。注：仅包括来自柯本气候区和Dai等人(2020)以氯作为残留消毒剂的样品。

  饮用水病毒群编码代谢的基因有可能增强微生物宿主的代谢过程

  本研究中确定的大多数病毒基因与公共数据库中的已知基因的同源性较低，只有25%的样品有Pfam注释，6%的样品具有KEGG标注的分子功能。在六种最常见的Pfams中，两种是噬菌体结构蛋白家族，四种是噬菌体非结构蛋白(图5C)。最丰富的四个代谢途径是核苷酸代谢(44%)、辅助因子和维生素代谢(18%)、氨基酸代谢(11%)和碳水化合物代谢(10%)。在饮用水的寡营养环境中，这些基因以及编码与辅助因子和维生素代谢相关蛋白质的基因有助于噬菌体宿主的存活或增强病毒的复制能力。

  在饮用水病毒组中发现了与氮代谢调控基因的相关蛋白(表S8)，包括碳酸酐酶(K01673)、谷氨酰胺合成酶(K01915)、亚硝酸盐氧化还原酶(K00370)、谷氨酸脱氢酶(K15371)和固氮蛋白 NifU (K04488)等。最常见的与氮代谢基因相关的是谷氨酰胺合成酶，其次是固氮蛋白NifU。病毒存在编码氮代谢相关的基因表明，在饮用水分配系统中，病毒可能通过连接宿主代谢途径以促进对宿主的感染或通过介导营养应激相关基因的水平基因转移来影响宿主的营养代谢水平。

  图5 饮用水病毒组的代谢潜力。 (A) dbRDA 排序揭示了基于残留消毒剂的使用和水质的病毒代谢潜力的多样性的关系;(B) Dai 等人的样本的 KEGG Ontology (KO) Pathway 模块相对丰度;(C)蛋白质丰度(Pfam)。

  结论

  宏基因组分析使研究人员能够对微生物群落进行全面评估，并为更有针对性的研究提出建议。我们的研究结果表明，使用残留消毒剂的饮用水系统的病毒多样性和群落结构较少，但病毒宿主的代谢潜力相对较高。此外，饮用水的取样位置、当地的气候变化、处理方法等环境条件，以及水质参数(如氯、氨、磷酸盐、硝酸盐、TOC和DO浓度等)都会对饮用水中病毒群落结构造成影响，深入研究发现，这些因素对病毒宿主的代谢潜力也产生了诱变作用。

  参考文献

  Hegarty B, Dai Z, Raskin L, et al. A snapshot of the global drinking water virome: Diversity and metabolic potential vary with residual disinfectant use[J]. Water Research, 2022,218: 118484.