黄曲霉毒素B1是丝状真菌(特别是黄曲霉和寄生曲霉)作为次级代谢产物自然产生的真菌毒素，主要污染谷物、香料、棉籽、油籽和各种坚果等农产品，并导致人类和动物黄曲霉毒素中毒。因此，毒素降解方法越来越受到科学界和工业界的关注。物理、化学和生物方法可以降解黄曲霉毒素B1.但前两者具有局限性，如产品营养质量损失、不良健康影响和设备费用昂贵等。因此，使用微生物细胞或酶的生物方法为消除毒素和保证食品安全、饲料质量提供了一个有吸引力的选择。

  目前，已报道了许多能够降解黄曲霉毒素B1的微生物，其中枯草芽孢杆菌作为一种具有多种能力(抗生素特性、酶生产和生物控制剂)的革兰氏阳性细菌，在食品、饲料和生物医学工业中具有多种优势和应用价值。该研究筛选得到具有黄曲霉毒素B1降解活性和α-溶血活性的枯草芽孢杆菌BCC 42005.并对其降解活性的细胞位置、活性最佳条件和抑制剂、毒性及其应用等进行了描述。

  降解黄曲霉毒素B1的芽孢杆菌筛选

  枯草芽孢杆菌BCC 42005分离物是本研究发现的唯一一个具有α-溶血活性的分离物，因此仅选择其进行进一步研究(图1)。

  图1.三次测定32株芽孢杆菌分离物降解黄曲霉毒素B1的百分比平均值±标准偏差。

  黄曲霉毒素B1降解活性的定位

  非诱导条件下枯草芽孢杆菌BCC 42005的胞外部分表现出最高的黄曲霉毒素B1降解活性(22.25%)(图2)。在培养过程中，从细胞内和膜相关组分中未观察到黄曲霉毒素B1降解活性。黄曲霉毒素B1的非诱导和诱导条件下，细胞外组分之间没有显著差异。

  图2.枯草芽孢杆菌BCC 42005不同细胞组分在不同时间与黄曲霉毒素B1孵育和不孵育的黄曲霉素B1降解活性。条形图表示标准偏差(n=3)。

  细胞外组分对黄曲霉毒素B1降解活性的表征

  胞外温度对黄曲霉毒素B1降解活性的影响

  枯草芽孢杆菌BCC 42005的细胞外部分在50°C时表现出最高的黄曲霉毒素B1降解活性(图3)。然而，黄曲霉毒素B1的降解活性在25–45°C时仍保持在50%以上。对于热稳定性，细胞外部分在25–60°C的温度范围内保持稳定，剩余活性在85%到100%之间。高于60°C时，活性急剧下降，80°C时未观察到降解活性。

  图3.枯草芽孢杆菌BCC 42005胞外部分的温度曲线(a)和稳定性(b)。条形图显示了标准偏差(n=3)。线上的不同字母代表显著差异(p≤ 0.05).

  pH值对黄曲霉毒素B1降解活性的影响

  枯草芽孢杆菌BCC 42005的胞外部分在pH值为8.0时表现出最高的黄曲霉毒素B1降解活性。在pH值为12.0时未检测到活性。降解活性在pH5.0–8. 0范围内稳定。当pH值大于9.0时，黄曲霉毒素B1降解活性显著下降。在pH值为11.0时降至20%以下(图4)。

  图4.枯草芽孢杆菌BCC 42005胞外部分的pH值曲线(a)和稳定性(b)。条形图显示了标准偏差(n=3)。线上的不同字母代表显著差异(p≤ 0.05).

  抑制剂对黄曲霉毒素B1降解活性的影响

  在1 mM叠氮化钠、1 mM二硫苏糖醇(DTT)和1 mM羟胺存在下(均为还原剂)，黄曲霉毒素B1降解活性受到强烈抑制(表1)。

  表1.各种抑制剂对枯草芽孢杆菌BCC 42005*胞外部分降解活性的影响

  *每个细胞外部分溶液在室温下与相同体积的抑制剂孵育15分钟，并在标准分析条件下测量残余活性。列中的不同字母表示显著差异(p<0.05)

  细胞毒性试验

  通过MTT法测定线粒体代谢活性，评估不同浓度下枯草杆菌BCC 42005细胞外部分的体外细胞毒性。该研究所用细胞外部分浓度(2.8mg/ml)低于三种哺乳动物细胞系(Caco2、HepG2和Vero细胞)的IC50值(表2)。

  表2.与对照组(不含枯草芽孢杆菌BCC 42005细胞外部分的细胞系)相比，使用枯草芽胞杆菌BCC 32005细胞外组分处理后的细胞系存活率。

  黄曲霉毒素B1在污染玉米籽粒中的降解

  酶浓度(5-40U)和培养时间(30-180min)对玉米籽粒黄曲霉毒素B1降解活性的影响。对于受污染玉米粒中的黄曲霉毒素B1降解活性，在培养120分钟(图5a)和25 U酶浓度(图5b)时，在玉米粒外观没有任何变化的情况下观察到最高活性，约为45%。

  在不同处理下浸泡后的玉米粒外观如图6所示。通过可视化，玉米粒的外观仍然是相同的，尽管它们在不同的处理下浸泡过。颜色测量证实了该结果，表明所有试验处理之间没有显著差异(表3)。与未经处理的玉米粒相比，玉米粒的营养成分、水分含量、粗蛋白质和粗脂肪也没有显著差异。

  将受污染的玉米浸泡在水中，添加或不添加枯草芽孢杆菌BCC 42005的细胞外部分。用水处理玉米180分钟只能减少约25%的黄曲霉毒素B1.并且玉米中仍有75%以上的毒素残留;而水和枯草芽孢杆菌BCC 42005的细胞外部分的组合可以在120分钟内将黄曲霉毒素B1降低约45%。

  图5.在不同酶浓度(a)和时间(B)下，用枯草芽孢杆菌BCC 42005胞外部分浸泡后，受污染玉米粒中残留黄曲霉毒素B1的百分比。平均值±标准偏差来自三次测定。

  表3不同条件浸泡后玉米粒中黄曲霉毒素B1残留量、外观和营养成分。

  DI，去离子水和。EX，细胞外组分。三次测定的平均值±标准偏差。同一列中的不同字母(a、b、c)表示存在显著差异(p<0.05)。

  图6.不同条件下浸泡后的玉米粒外观：未处理的玉米粒，(a);去离子水浸泡后的玉米粒，(b);以及用去离子水和细胞外部分浸泡后的玉米粒，(c)。

  总结

  从发酵谷物制品中分离到的32株芽孢杆菌具有降解黄曲霉毒素B1的能力。枯草芽孢杆菌BCC 42005因其黄曲霉毒素B1降解活性和α-溶血活性而被选择用于研究。结果表明，从非洲刺槐豆中分离的枯草芽孢杆菌BCC 42005细胞外部分具有降解黄曲霉毒素B1的能力。在50°C和pH值为8.0时降解活性最大，且在pH为5.0-8.0及温度为25-60℃范围内稳定。枯草芽孢杆菌BCC 42005胞外部分的IC50为4 mg/ml，可与水混合作为一种潜在有效的预处理浸泡剂，接触玉米120 min后黄曲霉毒素B1减少54%，也可用于减少其他食品和商品饲料中的黄曲霉毒素B1污染。

  参考文献：Watanakij Namon,Visessanguan Wonnop,Petchkongkaew Awanwee. Aflatoxin B1-degrading activity from Bacillus subtilis BCC 42005 isolated from fermented cereal products.[J]. Food additives & contaminants. Part A, Chemistry, analysis, control, exposure & risk assessment,2020.37(9).

  doi:10.1080/19440049.2020.1778182.