摘要：噬菌体内溶素是抗生素有希望的替代品。然而，它们被认为对革兰氏阴性菌的效果较差，除非进行工程设计，例如将它们融合到抗菌肽 (AMP) 中。本实验在噬菌体内溶素(Pae87)的AMP P87基础上，设计了新的肽P88，根据杀菌活性，细胞毒性等对其进行评估。结果表明P88 的杀菌性能优于 P87，P88对一系列铜绿假单胞菌具有抗菌活性，未发现内在抗性因子，在体外实验和呼吸道感染小鼠模型中观察到P88与某些抗生素的协同作用。因此，P88可以作为替代抗菌剂治疗的新补充。

  一、实验结果

  1、优化 AMP

  基于蛋白质结构内较高的净电荷和疏水矩使肽与革兰氏阴性表面相互作用的机会更大的原理，提出了肽P87(图1a)的几种修饰以提高其杀菌活性(图1b)。JPred二级结构预测这种修饰不会显着阻碍新的肽P88螺旋倾向(图1c)。圆二色性远紫外光谱在较高的TFE浓度下可以看到≈222和208nm处的峰(图2a)，这表明P88保留了在生物膜存在下形成α螺旋的能力。使用膜透化探针NPN和SYTOX测定表明，等摩尔浓度的P88比P87更有效地透化生物膜(图2b，c，d)。以上结果证明P88比亲本P87具有更好的裂解细菌能力。

  图1肽P88的设计

  图2 P88形成两亲性螺旋并透化生物膜的能力

  2、新型肽P88与P87的抗菌活性比较

  将肽P88与等摩尔量的P87进行了铜绿假单胞菌PAO1抗菌活性比较。P88具有快速裂解细菌作用(图3a)，杀伤效率比P87提高了10倍(图3b)，在5μM时迅速达到最大抗菌活性，P87则需要20μM时才达到最大抗菌活性(图3c)，P88在pH值=6达到最大抗菌活性，pH=7.5时失去活性(图3d)，杀菌谱与P87相同，但P88显示出更高的抗菌活性(图3e)。

  图3 肽P87和P88对不同细菌的杀菌活性评估

  针对一系列临床铜绿假单胞菌菌株测试P88活性，以评估细菌遗传变异性对其抗菌潜力的影响。实验使用的所有30个铜绿假单胞菌临床分离株均被证明对P88敏感，在杀伤效应的幅度上观察到相对较低的变异性(图4a)，不同来源的菌株之间的药敏性没有显著差异(图4b)。

  图4 铜绿假单胞菌遗传变异性对P88活性的影响.

  不同菌株中结晶紫(CV)定量生物膜之间存在相当高的变异性(图5a)，选择两种临床菌株(126.1和57.1)观察Pae87、P87、P88对其生物膜的清除作用，结果表明P88的清除作用最好。

  图5 Pae87衍生肽对铜绿假单胞菌生物膜的活性测试

  3、肽P88的细胞毒性

  亲本酶Pae87在测试的浓度下没有显示出显着的细胞毒性作用(图6a)，但P87和P88对A549细胞都有一定的毒性(图6b，c)，但如果肽用于消毒或食品保存等应用，这种细胞毒性可能不是问题。

  图6 Pae87衍生肽对A549细胞毒性

  4、P88与抗生素的协同作用

  P88分别与抗生素ERY、CHL 和 TET 在 39.5 菌株中具有协同作用(FICI≤0.5)(图 7a，b)。使用0.25×MIC的P88，没有显示活细胞计数显著降低，但抗生素的浓度为0.25× MIC时活细胞计数会减少。将抗生素与肽联用时，细胞活计数比单独使用抗生素或肽降低至少2log，也满足了协同作用的要求标准(组合中杀伤效果比单独每种化合物的作用总和高2log)。

  图7 肽P88与几种抗生素的协同作用

  二、实验结论

  综上所述，在之前的研究中来自噬菌体内溶素Pae87的肽P87已被测试为有效替代抗菌剂的来源。为了提高其抗菌功效，设计了一种具有增加的疏水矩和净电荷的衍生肽P88，并证明其具有增强的杀菌和抗生物膜活性，还与抗生素具有协同作用，可进一步用作常用抗生素的替代治疗剂。

  参考文献：Vázquez Roberto,DoménechSánchez Antonio,Ruiz Susana,Sempere Julio,Yuste Jose,Albertí Sebastián,García Pedro. Improvement of the Antibacterial Activity of Phage Lysin-Derived Peptide P87 through Maximization of Physicochemical Properties and Assessment of Its Therapeutic Potential[J]. Antibiotics,2022,11(10).