摘要：使用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂(TCBS)作为选择性培养基的海洋弧菌的分离/计数可能受到不同分类群对培养基的可变适应性的阻碍，甚至可能导致分离失败或总计数严重低估。我们提出了一种改良的TCBS作为分离培养基，根据海洋弧菌的要求进行了调整，与标准培养基相比，大大提高了在稀释平板计数中的覆盖率。与TCBS相比，改良培养基具有显著的优势，可以更准确、更可能地估计弧菌的实际存在。改良的TCBS允许回收未检测到的弧菌，其中一些产生生物技术上有价值的酶，从而将分离能力扩大到可能产生新酶的弧菌分类群。此外，还新设计了一种弧菌特异性PCR引物对，针对一个独特的rpoD序列，有助于快速确认分离物为弧菌成员和随后的遗传分析。

  从食品制造/加工到生物医学制药应用，微生物酶在多个领域有着广泛的应用。与传统来源分离的酶相比，海洋微生物生产的酶在操作条件下(即相对较高的离子强度、低温或高温、极端pH值)和不同类型的功能特性中通常表现出更高的稳定性和活性，且使用海水作为反应介质已被认为是特定工艺的一种优良的替代方案。

  在为生物技术目的挖掘蛋白水解活性的背景下，弧菌属是最有前途的的蛋白酶产生细菌之一。此外，作为水生细菌，它们有望产生高活性的分泌酶，能够识别和消化浓度非常低的底物，也有能力将小分子移动到可以发生消化的周质空间。弧菌属是一个以其高频率的基因交换(尤其是一些分支)而闻名的细菌属，导致了非常快速的进化和基因组可塑性;因此，具有新型功能阵列以及可能的生理特征(包括在特定培养基上生长的能力)的菌株有望持续出现。

  使用各种选择性和差异培养基从环境样本中分离弧菌，大多数旨在检测致病性弧菌，其中一些培养基仅允许选定弧菌的生长。硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖琼脂是用于分离和纯化弧菌的一种选择性培养基，目前仍大量使用。TCBS已广泛用于从临床标本和食品以及水生环境中分离致病性弧菌(霍乱弧菌、副溶血弧菌、创伤弧菌)。此外，它还被指定为所有弧菌的分离/计数培养基(除了霍利斯弧菌和麦氏弧菌)。在该培养基上，不同的弧菌(即霍乱弧菌、溶藻弧菌、哈维弧菌)可以根据发酵蔗糖的能力进行区分，从而产生黄色菌落;相反，非发酵弧菌，如创伤弧菌和副溶血弧菌，出现绿色菌落。尽管TCBS对弧菌有选择性，但葡萄球菌属、黄杆菌属、假交替单胞菌属和希瓦氏菌属等也可以在其生长，但由于其独特的表型，它们的菌落可能与弧菌不同。对于海洋弧菌，与大多数海洋细菌类似，盐成分含量及其重要;然而，TCBS盐含量差异很大，很可能不适合确保最大限度地回收海洋弧菌。

  在这项研究中，我们发现TCBS实际上不能完全适用于海洋弧菌的分离，其回收率通过改良可得到显著提高，从而改善了旨在分离有价值的产酶弧菌的环境调查。特别是，我们验证了TCBS的盐成分可能会阻碍海洋弧菌的恢复。TCBS中盐成分的校正导致海洋样本中弧菌总数的显著提高。此外，还设计了针对独特rpoD序列的弧菌特异性引物对，以快速进一步确认分离物为弧菌成员。

  改良培养基试验

  与TCBS(标准培养基)相比，使用除TCBS‐S以外的各种改性培养基(即mTCBS、mTCBS‐2、mTCBS-aSW、TCBS‐S和TCBS+MB)，观察到弧菌菌落数量平均增加了两倍(图1和图2)。用NaCl补充TCBS并没有导致改性培养基菌落计数增加，表明其他配方所获得的提高的回收率主要来自总盐含量(即化学元素混合物的可用性)，而不是离子强度本身。

  使用75%海水(mTCBS)或SW(mTCBS-aSW)代替纯SW(如TCBS-2)，略微降低盐含量被证明是有益的，因为它提高了菌落大小，而不降低改性培养基相对于标准TCBS的优势，可能是因为总体盐浓度更均衡。TCBS+MB支持了最茂盛的生长，产生了非常大的菌落，可能是由于营养浓度高得多，再加上平衡的盐混合物(数据未显示)。然而，由于不能完全排除两种介质的组合可能部分损害选择性的可能性，因此选择了mTCBS或mTCBS‐aSW进行以下分析。

  为了验证盐含量的改变不会影响选择性，用不同弧菌对改性培养基进行了验证。所有配方都支持所有受试海洋弧菌的生长，而其他属细菌的生长受到抑制(表1)。

  使用弧菌特异性rpoD引物对，通过PCR测试确认在改良培养基上获得的菌落为弧菌，该引物对之前在硅芯片和体外都进行了验证(表2)。

  改良培养基改善细胞适应和存活

  从标准培养基和改良培养基的比较中获得的结果促使我们调查哪些弧菌不能在标准培养基上生长。为此，从显示出最相关计数差异的样品中选择琼脂平板进行进一步研究。特别是，在mTCBS上生长的90个单菌落在TCBS和mTCBS两种培养基上进行了挑选，以确定导致观察到的平板计数差异的细菌。出乎意料的是，90个选定的分离株中有87个同时在TCBS和mTCBS上生长，而其中只有约50%预计会生长。据推测，在TCBS上分析天然样品时观察到的较低菌落回收率可能反映了某些分离物的大多数细胞对选择性培养基的适应性较差，而不是完全无法生长。

  为了研究这种可能性，将87个分离株在海洋肉汤(作为非选择性培养基)中生长，适当稀释，并在MA(作为阳性对照)、TCBS和mTCBS平板上斑点。

  在MA和mTCBS上，观察到了类似的生长，所有斑点均显示融合生长，而在TCBS上90个测试分离株中的57个在最低稀释度下仅产生了几个不同大小的菌落(其中大多数非常小)，而在较高稀释度下没有菌落，因此支持了我们的假设。

  为了排除这种结果可能是由于遗传异质性，从TCBS上的斑点获得的小菌落和大菌落都被分离，在MB中生长(以排除任何选择)，并再次进行测试。菌落大小被证明不是固有特征，因为无论起始菌落大小如何，在mTCBS和MA上都获得了正常和均匀大小的菌落;然而，在TCBS上再次观察到低回收率和菌落大小异质性。这些结果支持细胞对TCBS的适应率低的假设，表明在TCBS平板上观察到的菌落大小减少可能与少数单个细胞对培养基的后期适应相对应，这导致生长困难/延迟。综合考虑这些观察结果，可以解释mTCBS与TCBS相比的不同恢复能力。

  弧菌识别

  根据核糖体基因间间隔区模式，对TCBS上生长减少或无生长的所有弧菌分离株进行分组，并通过16SrDNA PCR扩增和测序选择其中一个代表性分离株(共四个;即VD、VL、VN、VO)进行分子鉴定。

  BLAST分析将VD和VN序列分配给具有相同分数的巨型弧菌和厚壳弧菌;VN和VO被分配给卡那罗弧菌。

  为了实现更精确的分离物鉴定，两个额外的分类信息位点，即rpoD和gyrB，作为单个序列和通过多位点序列分析(MLSA)进行了分析。

  对所有rpoD序列进行BLAST分析，对弧菌鉴定常用的区域进行分析，结果表明，与Vibrio toranzoniae的同源性最高(99%);VO序列也显示出与卡那罗弧菌的相同性。相反，对整个序列的分析显示，在所有四个序列中，与厚壳型弧菌的同源性为94%;溶藻弧菌(V.alginolyticus)和灿烂弧菌(V.splendidus)也发现了相同的匹配，得分非常相似。取而代之的是，MLSA将所有分离株都归为厚壳弧菌科。这种不同的结果可能是由于数据库中可用的序列，特别是完全测序的基因组(事实上，MLSA依赖于测序的基因组)仅存在于少数物种，因为数据库中发现的许多序列源自特定基因座的部分测序，因此，对更多扩展序列的生物信息学分析可能导致对具有测序基因组的物种的偏见。

  然而，不排除相关物种之间水平基因转移导致“混合”基因组的可能性，这可能与此类分离株的行为一致。

  分离物的蛋白质分解活性

  为了检测和表征环境分离物的蛋白水解活性，包括分子大小分布，通过酶谱法对鉴定的细菌进行电泳分离后的明胶酶活性筛选。所有分离株，包括四个特征分离株，都显示出不同的分泌蛋白水解酶模式，其分子量低于40 KDa(图3)。

  这些结果表明，它们作为低分子量分泌蛋白酶的来源具有应用潜力，进一步的功能分析表明，即使在恶劣条件和低温下，这些蛋白酶主要是丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。进一步的功能分析表明，主要是丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，即使在恶劣条件和低温下也具有高度活性。

  低分子量酶，以及那些在极端条件下表现出高稳定性和活性的酶，对其潜在的生物技术应用特别有吸引力。事实上，在必须消化困难底物(即蛋白质废物)或严格控制低温是强制性要求的情况下，可以利用这种酶的特性。此外，小尺寸提高了向三维结构的快速扩散，因此这些分离物产生的一些酶正在组织分离中进行测试。此外，这些特征使得这些蛋白酶对于易于重组和大规模生产具有吸引力。

  结论

  本文报道的数据清楚地表明，一些海洋弧菌不能在选择性培养基(如标准TCBS琼脂)上生长，这导致总体低估和可能感兴趣的细菌损失，并且它们需要调整培养基成分才能成功分离。

  改良培养基的使用使我们能够分离出未被检测到的弧菌，这些弧菌被证明能够产生具有生物技术吸引力的低分子量酶，这突出了提高分离能力如何能够极大地有助于扩大从自然环境中提取的合适酶的库。这些数据使我们强烈建议在海洋弧菌的任何分离/计数工作中使用改良的TCBS。

  且使用改良的TCBS培养基大大提高了此类微生物的总体回收率，有助于通过培养评估弧菌的存在，以及对其进行分离。

  此外，新的弧菌特异性rpoD引物对为通过直接PCR快速进一步确认分离物为弧菌属成员提供了有用的工具，而与短得多的片段的测序相比，rpoD扩增子测序可为随后的物种鉴别和鉴定提供额外信息。

  本文提出的改良分离培养基大大提高了从海洋样品中回收和分离弧菌的能力，用于生物技术和环境监测目的。应考虑使用可更好地满足细菌生理要求的调整培养基。此外，新设计的rpoD引物可方便地评估任何分离物的弧菌成员，并可为弧菌分离物的鉴定和分类研究提供一种改进的工具。