副溶血性弧菌是弧菌科弧菌属的成员，是一种革兰阴性、嗜盐细菌，广泛分布在海洋和河口环境中。它是最重要的人畜共患病原体之一，这种细菌引起弧菌病，其临床表现为肠胃炎和腹泻。

  周海波等建立一种基于 PMA-duplex ddPCR的水产品中副溶血弧菌活菌定量检测方法，他针对新基因 vp0488的特异性引物和探针，经本实验室自行筛选的推定 DNA 聚合酶 III β 链的编码，以及传统的靶基因，热溶血溶酶 ( tlh) 的设计和验证。

  ddPCR技术是在进行传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，每个微滴或不含待检基因，或者含有一个基因。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出待检基因的起始拷贝数或浓度。基本技术流程如下图。

  一般来说，食物样本携带的混合细菌种群维持在活的、死的和活的但不可培养的(VBNC)状态，分别是指膜完整的可培养细胞、膜受损的不可活细胞和膜完整的不可培养细胞。不幸的是，PCR是基于核酸扩增，无法独立区分活细胞和死细胞。而一种光敏核酸染料叠氮原(pro - pidium monoazide，PMA)被用于选择性穿透膜完整性受损的受损细胞，可以在检测区分活细胞和死细胞。

  PMA 处理程序的引入有效地消除了死亡细菌的干扰，PMA-duplex ddPCR 方法可以用于枚举真实食物样本中的低浓度活细胞。

  参考文献

  [1]. Haibo Zhou, Xinmei Liu, Zhaoxin Lu and so on, Quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus in aquatic products by duplex droplet digital PCR combined with propidium monoazide. in Food Control by Contents lists available at ScienceDirect, 2023.