多重细菌检测对于监测关注多种病原体的各种病原体情况至关重要。本文将双噬菌体扩培策略(PAA)的高灵敏度和多重检测技术的特异性相结合，探索了一种新方法，该方法能够快速、特异、灵敏地同时定量检测常见食源性病原体——沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。实验验证了单次和多次反应的分析灵敏度、特异性和稳定性，结果显示该方法对所有细菌的检出限均为10 CFU/mL，成功应用于实际食品样品中，可将检测时间缩短4 h以下，为同时检测活菌提供了一种有效且有前景的方法。

  一、实验流程

  以两种新型沙门氏菌噬菌体SEP37和葡萄球菌噬菌体LSA2311为基础，对PAA进行开发。通过检测噬菌体靶基因，保证了高特异性。然后采用PAA-based qPCR分别对沙门氏菌和葡萄球菌进行单病原体检测，将PAA与多重qPCR结合，同时检测这两种菌。

  图1 PAA—多重qPCR用于同时和多重检测食源性致病菌原理图

  二、实验结果

  1、杀病毒剂的选择

  PAA的一个关键组成部分是选择有效的杀病毒剂，实验评估了硫酸亚铁、FAS和七水硫酸镁(MAS)的杀病毒活性。结果表明，如图2所示，MAS组和对照组之间没有差异，FAS和硫酸亚铁组的噬菌体滴度显著降低，FAS有更好的稳定性。用浓度为30mM的FAS处理后，噬菌体在该浓度下可以完全失活。将FAS处理组与对照组比较，细菌生长没有显着差异。因此，FAS可被选为杀病毒剂。

  图2 噬菌体-SEP37介导的PAA的优化

  2、通过PAA-qPCR定量检测沙门氏菌

  PAA-qPCR测定使用引物和TaqMan探针来靶向位于沙门氏菌噬菌体SEP37上的尾部基因。制备一系列10倍稀释的噬菌体SEP37 DNA以计算扩培效率并生成标准曲线，扩增效率为104%。循环阈值(Ct)值>1时，样品被认为是沙门氏菌阳性。检测限(LOD)被定义为产生Ct值信号变化的最低细菌浓度。如图3所示PAA-qPCR检测能够检测LOD为10 CFU/mL的沙门氏菌。对5种主要食源性病原体进行检测，沙门氏菌和沙门氏菌的混合物组的Ct值明显低于其他组的Ct值，表明该测定可以特异性检测LOD为10 CFU/mL的活沙门氏菌。

  图3 PAA-qPCR定量检测沙门氏菌

  3、PAA-qPCR定量检测金黄色葡萄球菌

  基于葡萄球菌噬菌体LSA2311的末端酶基因的大亚基设计了一组引物和Taqman探针。制备一系列10倍稀释的噬菌体LSA2311 DNA以计算扩培效率并生成标准曲线。PAA-qPCR结果如图4，Ct值在1-10之间呈线性，扩增效率为108%，LOD 为 10 CFU/mL。PAA-qPCR测定可以特异性检测活的金黄色葡萄球菌ATCC25923及其混合物。

  图4 PAA-qPCR定量检测金黄色葡萄球菌

  4、PAA介导的多重qPCR检测

  以不同靶标噬菌体DNA拷贝数的对数作为横坐标，评估多重qPCR扩增效率。如图5所示，PAA介导的多重qPCR测定与PAA介导的沙门氏菌或葡萄球菌qPCR测定的扩增效率之间没有显着差异。制备不同浓度的沙门氏菌和金黄色葡萄球样品，使用标准曲线推导样品浓度，结果表明两种菌的检出限低至10 CFU/mL，且该测定具有高度特异性。

  图5 PAA-多重qPCR的敏感性、特异性和稳定性

  5、食物样品评估PAA-多重qPCR检测方法

  采用基于PAA-多重qPCR方法对牛奶、生菜里的沙门氏菌和金黄色葡萄球菌进行定量。不同浓度的沙门氏菌和葡萄球菌被到样品中。如图6所示，牛奶、生菜样品中两种细菌的检测限均为 10 CFU/mL。

  图6 牛奶、生菜样品评估PAA-多重qPCR检测方法

  三、实验结论

  研究人员提出了一种基于噬菌体扩培(PAA)和多重qPCR同时检测肠道沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的策略，具有高度特异性和准确性，该方法可使检测限可在4 h内降低至10 CFU/mL，成功地在真实食物样品(牛奶、生菜)上进行了验证，所得结果与传统平板计数相当。该方法快速、简便、成本低，可用于现场筛查，防止各种食品中食源性病原体的污染。

  参考文献：Huang Chenxi,Zheng Ranjing,Ding Yifeng,R. Nugen Sam,Wang Xiaohong. Dual phage amplification-mediated multiplex detection strategies for the simultaneous detection of Salmonella enterica and Staphylococcus aureus[J]. Talanta,2023,253.