胃肠道微生物组因其在许多疾病中的作用而受到广泛研究。然而，缺乏专为微生物组递送而设计的技术。因此，输送益生菌以影响和调节微生物组的组成可能会影响许多人类疾病的治疗。本研究报告了一种用于逐层包封益生菌的方法，以保护益生菌免受胃肠道损伤并改善益生菌在肠道表面的粘膜粘附和生长。这些优势使LbL-益生菌在体内的存活能力显着增强。

  研究结果

  益生菌菌株凝结芽孢杆菌(BC)通过LbL方法使用两种可生物降解的多糖-壳聚糖和海藻酸盐，成功包封(图1a)。BC是一种产生乳酸的益生菌，已显示出治疗结肠炎以及与肠易激综合征相关的腹痛和腹胀的潜在功能。普通BC的明场成像和(CHI/ALG)2-BC显示LbL模板化可导致益生菌聚集。这发生在添加末端藻酸盐层之后，与溶液pH无关，并且可能是由于海藻酸盐在NaCl溶液中的组装。普通BC的扫描电子显微镜(SEM)成像和 (CHI/ALG)2-BC显示LbL封装并没有显着改变BC表面形态，这可能是由于革兰氏阳性细菌细胞壁中已经存在多糖。Zeta电位测量(图1c)证实了壳聚糖和海藻酸盐的成功分层。这意味着最多三个壳聚糖/藻酸盐双层的统一模板。在模拟肠液(SIF;pH 7)和模拟胃液(SGF;pH 2)中研究了封装聚合物的释放。在SGF中4小时后，约30%的总海藻酸盐和约20%的总壳聚糖不再与封装的益生菌相关联。为了证明(CHI/ALG) LbL-益生菌在仍被包封的情况下生长和增殖的能力，检查了层数对BC生长的0、1、2和3个双层(CHI/ALG)的影响。在每种情况下，LbL-益生菌在仍被包裹的情况下都保持了生长和增殖的能力，表现出滞后期、指数期和稳定生长期(图 1e)。在三个双层中，指数期延迟超过10小时，这突出了仍然包封的益生菌生长的关键阈值;因此，最多两个双层被用于进一步的实验。LbL-probiotics还增强了细菌活力，其中在水中一周后，在冷藏和室温条件下，与(CHI/ALG) 2 LbL-BC相比，未封装的BC的菌落形成单位减少了1个对数以上。

  图1 逐层包裹益生菌。

  本研究通过模拟胃液和肠液消化益生菌及益生菌微胶囊。在这两种情况下(图2a、b)，BC暴露于SGF或胆汁盐30分钟后发生快速细胞死亡。在2小时后酸性损伤的情况下观察到CFU完全减少，表明细胞完全死亡(图2a)。可见BC不能在酸性条件下存活，虽然BC已显示对低浓度的胆汁盐有抵抗力，它们仍然对较高的胆汁盐浓度敏感，并且在这种情况下，在4%胆汁盐溶液中2小时时，CFU最多减少6个对数(图 2b)。五种不同的LbL配方，包括：(i) 单独的壳聚糖(CHI) 1，(ii) 单个双层壳聚糖/藻酸盐 (CHI/ALG) 1，(iii) 两个壳聚糖/藻酸盐双层(CHI/ALG) 2，(iv) 单个双层壳聚糖/L100(一种肠溶聚合物)(CHI/L100) 1和(v)两个双层壳聚糖/L100 (CHI/L100) 2研究了它们保护BC免受酸和胆汁侵害(图 2c)。单层壳聚糖(CHI) 1不足以保护BC免受胆汁盐或酸的侵害(图 2c)。当BC封装在(CHI/ALG) 2中时，在SGF条件下观察到CFU减少不到1个对数，在2小时后在4%胆汁盐中观察到CFU减少不到2个对数(图 2c)。 (CHI/ALG) 2 LbL-BC与其普通、单双层包衣和肠溶包衣的对应物相比，在抵抗酸和胆汁损害方面表现出显着的生存优势;因此，进一步研究了(CHI/ALG) 2在肠组织上的粘附和生长。

  图 2 LbL涂层对益生菌存活抵抗酸和胆汁损伤的影响。

  使用新鲜分离的猪小肠切片研究了(CHI/ALG) 2 LbL涂层对益生菌粘膜粘附和肠道组织生长的影响。在37°C下孵育1小时并随后去除未粘附的益生菌后，与普通BC相比，(CHI/ALG) 2 LbL-BC对猪肠道粘膜表面的粘附性高出近1.5倍。(CHI/ALG) 2 LbL-BC的粘膜粘附优势可能源于壳聚糖层的粘膜粘附特性，此外，末端海藻酸盐层还通过其离子强度和溶胀特性提供粘膜粘附优势。这些结果表明LbL-BC提供的增强的粘膜粘附导致前6小时的生长优势。这可能是因为更多的益生菌在短时间点直接粘附在肠道组织上，因此它们复制并更快地达到指数生长期。

  图3 LbL涂层增强了益生菌的肠滞留能力。

  LbL涂层对体内益生菌存活和递送的作用通过口服管饲递送相同数量的生物发光纯BC和(CHI/ALG) 2 LbL-BC进行了研究。单层壳聚糖/藻酸盐和肠溶层制剂未在体内进行评估，因为它们没有提供针对SGF和胆汁损伤的保护作用(图2c)。给药后1小时，与普通BC相比，生物发光(CHI/ALG) 2 LbL-BC在胃肠道中发出的信号超过背景六倍(图4a–c)。图像突出显示(CHI/ALG) 2 LbL-BC (图4b)能够在恶劣的胃部条件下存活并到达富含胆汁的小肠。在体内，与普通BC相比，LbL-BC表现出显着的生存优势，可能是因为 (CHI/ALG) 2LbL-BC 在以下方面显着优于普通BC：(i) 对酸和胆汁损伤的生存(图2)，(ii) 在短时间点黏膜粘附和生长在肠道表面(图3)，(iii) 直接在肠道表面生长 (图3)。

  图 4 LbL涂层可提高益生菌在体内的存活率。

  总之，这项工作表明益生菌的LbL模板化提供了一种将特定益生菌物种引入胃肠道的有前途的策略。此处描述的LbL技术通过同时增强解决了化学、物理和益生菌特异性口服给药的挑战：(1)益生菌抵抗酸性和胆汁盐侵害的存活，(2)肠组织粘膜粘附和生长，(3)体内存活。此外，LbL-益生菌封装可能与几乎任何带电聚电解质、蛋白质或多糖一起使用，并与任何益生菌菌株结合使用。特别是，这项研究为旨在将活的益生菌引入胃肠道微生物组以改善人类健康的技术奠定了基础。

  原文参考：Anselmo AC, McHugh KJ, Webster J, Langer R, Jaklenec A. Layer-by-Layer Encapsulation of Probiotics for Delivery to the Microbiome. Adv Mater. 2016 Nov;28(43):9486-9490. doi: 10.1002/adma.201603270. Epub 2016 Sep 12. PMID: 27616140; PMCID: PMC5287492.