耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是一种抗生素耐药性细菌，可引起肺炎、菌血症和心内膜炎等感染。MRSA的快速准确诊断是正确治疗感染的先决条件。抗微生物药敏试验通常被用作MRSA检测的金标准，然而，时间成本和假阴性结果阻碍了它的应用，而使用昂贵的抗体阻碍了免疫学方法的应用。新兴的基于核酸的方法似乎比其他方法更有优势，因为可以直接鉴定相关的抗生素耐药性基因。

  靶DNA激活的RNA引导的CRISPR/Cas12a系统可以不加区分地切割任何非靶单链DNA，使其能够用于核酸靶标的扩增检测，使核酸检测超高的特异性(单核苷酸分辨率)和敏感性(单分子水平)。到目前为止，各种基于CRISPR/Cas12a的核酸检测包括荧光分析、侧流分析、电化学方法、表面增强拉曼散射(SERS)、数字微流体和比色法等。由于其设备独立性、可负担性和可视化，基于CRISPR/Cas12a的比色方法显示出最大的现场应用潜力。这些方法通常使用金纳米粒子(AuNP)作为信号探针，ssDNA作为智能材料来调节其分散和聚集，以研究颜色变化。尽管取得了很大的成功，但这种ssDNA调控的AuNPs状态改变通常是通过DNA杂交实现的，是一对一的信号转导，其灵敏度不足以检测对灵敏度要求较高的MRSA。

  在本研究中，利用CRISPR/Cas12a系统和重组酶聚合酶扩增(RPA)开发了一种基于适体的比色生物传感器，用于快速、超灵敏和视觉检测MRSA。在该感知策略中，利用一个适配体通过Ag+与胞嘧啶(C)的N3相互作用螯合银离子(Ag+)，桥接两个胞嘧啶残基，形成强而稳定的“C - Ag+-C”发夹结构。同时，由于该适配体具有ssDNA的特性，可作为CRISPR/Cas12a反式裂解的底物。此外，利用Ag+，3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)氧化的一种有机染料作为可见探针。

  与基于AuNPs的CRISPR诊断相比，所使用的适体包含大量胞嘧啶残基，可以与多个Ag+结合;此外，TMB的制备具有重复性和简单性，在MRSA检测中具有灵敏度和简单性优先。利用“RPA”、“CRISPR/Cas12a”和“适体- Ag+”的高效整合和三重信号放大，该基于适体的比色生物传感器可用于耐药细菌的特异性分析。

  图1 使用CRISPR/Cas12a系统和RPA的基于适体的比色生物传感器原理图。(A)适体与Ag+结合的原理图。(B)利用CRISPR/Cas12a系统和RPA，利用基于适体的比色生物传感器检测MRSA的原理图。

  从临床分离的菌落中提取的DNA首先通过RPA扩增，并通过CRISPR/Cas12a系统进一步识别。在MRSA存在的情况下，它激活Cas12a顺式切割目标DNA，并与其中一个产生的DNA片段结合。这种顺式裂解事件导致Cas12a构象移位，从而实现对适体的第二次非特异性反切，导致预耦合到磁性纳米颗粒(Apt-MNPs)的适体降解。通过磁选，沉积物只包含MNPs。此外，利用Ag+， 3,3 '，5,5 ' -四甲基联苯胺(TMB)氧化的一种有机染料作为可见探针。因此，Ag+不能与适体结合，而是与TMB反应着色。在这种情况下，含有氧化TMB (TMBox)的溶液在652 nm处显示出蓝色和特征的UV-vis吸收峰。在没有MRSA的情况下，配件切割不会发生，适体仍然是完整的，并通过磁架向下拉。在此过程中，Ag+与磁富集的核酸适应体结合，与胞嘧啶相互作用形成“C-Ag +-C”发夹结构，溶液在没有TMBox的情况下变为无色(图1B)。在这种策略中，适体首次同时作为放大器和信号放大和信号读出的连接器。与基于aunp的CRISPR诊断相比，所使用的适体包含大量胞嘧啶残基，可以与多个Ag+结合;此外，TMB的制备具有重复性和简单性，在MRSA检测中具有灵敏度和简单性优先。利用“RPA”、“CRISPR/Cas12a”和“适体- Ag +”的高效整合和三重信号放大，该基于适体的比色生物传感器可用于耐药细菌的特异性分析。

  这一种高效的基于适体的比色生物传感器由强大的CRISPR/Cas12a系统和RPA集成而成用于MRSA检测。通过三倍放大，这种方法实现了快速，视觉，超灵敏，特异性检测MRSA与LOD 8 CFU/mL在临床MRSA菌落分析中令人满意的准确性也表明了其强大的适用性。我们设想生物传感器可以很容易地扩展到诊断疾病的生物标志物编程相应的gRNA，它可能是服从的细菌鉴定和分型。基于CRISPR的完全集成、样本到结果和多路复用的策略有望提供进一步的改进和发展。

  参考文献：Wei L, Wang Z, Wang J, Wang X, Chen Y. Aptamer-based colorimetric detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus by using a CRISPR/Cas12a system and recombinase polymerase amplification. Anal Chim Acta. 2022 Oct 16;1230:340357.