在过去几年中，粘菌素耐药性逐渐增加，了解粘菌素耐药性的机制，开发针对粘菌素耐药超级细菌的新治疗策略具有重要意义。粘菌素属于两亲性多肽抗生素。粘菌素的杀菌作用包括最初与革兰氏阴性菌外膜中的脂多糖(LPS)静电结合，从而产生Ca2+和Mg2+的置换，然后脂肪酰基链插入外膜，导致细胞内容物泄漏。革兰氏阴性菌对粘菌素耐药性的最明确机制涉及对LPS的修饰。在大肠杆菌中，4氨基-4-脱氧-L-阿拉伯糖、磷酸乙醇胺(pEtN)和/或半乳糖胺修饰脂质A，导致LPS的负电荷减少，粘菌素和LPS之间的相互作用减少。虽然参与大多数这些修饰的基因都是染色体编码的，但2016年报道了第一个赋予质粒介导抗性的动员粘菌素抗性基因(mcr-1)，并对粘菌素耐药性在全球的传播构成了巨大威胁。MCR-1酶属于磷酸乙醇胺(pEtN)转移酶家族，附着在革兰氏阴性菌的内膜上。大肠杆菌中，mcr-1基因的表达导致向脂质A中添加磷酸乙醇胺，并对粘菌素产生耐药性。

  先前的研究表明，添加外膜囊泡(OMVs)可使大肠杆菌和丁香假单胞菌对粘菌素产生耐药性，然而，潜在的分子机制尚未完全阐明。

  主要内容：

  1、大肠杆菌OMVs的物理特性

  该研究使用了大肠杆菌K12和同基因大肠杆菌50434(带有mcr-1基因的大肠杆菌K11)。对这些菌株的OMVs进行了纯化。透射电子显微镜分析显示，这些大肠杆菌菌株在生长的对数后期释放OMVs。囊泡为球形，直径范围为50至200纳米(图1A、B)。OMVs的纳米颗粒跟踪分析(NTA)确定，从大肠杆菌08-85和大肠杆菌K12分离的OMVs的中值直径分别为134.2和124.9 nm(图1C、D)。两种方法对囊泡的大小分布基本一致。

  图1 大肠杆菌08-85、K12 OMVs物理表征

  2、OMVs保护一株易感大肠杆菌免受粘菌素感染

  从临床大肠杆菌ATCC25922和大肠杆菌08-85以及大肠杆菌K12和大肠菌50434中纯化了OMVs，并研究了OMVs对细菌生长的影响和对粘菌素的杀伤作用。粘菌素对大肠杆菌的MIC为1 μg/ml，而粘菌素对大肠杆菌ATCC25922和大肠杆菌K12的最低杀菌浓度(MBCs)为2 μg/ml。

  用2×MIC粘菌素(2 μg/ml)处理与0.2至20 μg/ml范围内的系列OMV孵育的大肠杆菌ATCC25922或大肠杆菌K12，以确保细菌不会在该浓度下生长。如图2A、B所示，在没有OMVs的情况下，大肠杆菌ATCC25922或大肠杆菌K12的细菌细胞根本没有生长。OMVs以浓度依赖的方式保护大肠杆菌ATCC25922免受生长抑制，20 μg/ml OMVs使细菌细胞生长最快，0.2 μg/ml OMVs使细菌细胞最慢或不生长(图2A)。值得注意的是，在相同浓度下，来自mcr-1阳性菌株大肠杆菌08-85的OMVs比从大肠杆菌ATCC25922分离的OMVs提供的保护更少(图2A)。同样，大肠杆菌K12受到20 μg/ml大肠杆菌K12-OMVs的保护，而在最初的12小时内，大肠杆菌50434OMVs完全抑制了生长(图2B)。

  在杀伤保护试验中(图2C、D)，单独的细菌细胞(黑条)和含有粘菌素的细菌细胞分别作为阳性和阴性对照(2 μg/ml，绿条)。对于临床大肠杆菌ATCC25922(图2C)，与阴性对照相比，20 μg/ml大肠杆菌ATCC2 5922 OMVs和20 μg/ml E.coli 08-85 OMVs都提供了免受粘菌素治疗的保护。然而，当与2 μg/ml OMVs孵育时，细菌细胞被大肠杆菌ATCC25922 OMVs完全保护，但不被大肠杆菌08-85的OMVs保护。0.2 μg/ml的大肠杆菌ATCC25922或大肠杆菌08-85的OMVs不能保护大肠杆菌ATCC2 5922对抗粘菌素。如图2D所示，与没有OMVs的大肠杆菌K12相比，20 μg/ml大肠杆菌K12-OMVs保护对粘菌素敏感的大肠杆菌K1 2免受粘菌素处理。然而，添加20 μg/ml大肠杆菌50434 OMVs对粘菌素的保护作用显著减弱。2 μg/ml大肠杆菌K12 OMVs和2 μg/ml E.coli 50434 OMVs都不能保护E.coli K12免受粘菌素的侵害。这些结果表明，与相同浓度的mcr1阴性菌株相比，来自mcr-1阳性菌株的OMVs减弱了保护作用。

  图2 生长曲线(A，B)和杀伤保护试验(C，D)

  3、该保护作用与OMVs对粘菌素的吸收有关

  了确定OMVs的保护作用在保护测定中观察到的是由于OMVs对粘菌素的吸收，使用结合脂质A的BODIPY TR cadaverine (BC),进行荧光位移测定。BC的荧光通过与脂质A磷酸基团结合而猝灭，并通过对脂质A显示亲和力的化合物去除猝灭的。如图3A所示，OMVs对BC的滴定导致BC荧光的浓度依赖性猝灭。如果粘菌素类似地与OMVs的脂质A结合，它应该取代BC探针并导致荧光强度增加。

  10倍系列稀释的粘菌素加入到与2μg/ml大肠杆菌K12或大肠杆菌50434的OMsV预孵育的BC(4mM)溶液中。BC的荧光随着粘菌素浓度的增加而增加，这表明粘菌素以剂量依赖的方式与OMVs结合(图3B)。这些结果表明，在相同浓度下，大肠杆菌K12的OMVs比大肠杆菌50434的OMVs吸收更多的粘菌素，并可以解释mcr-1阳性大肠杆菌菌株的OMVs所提供的减弱保护。

  图3 OMVs对BC的滴定(A)和粘菌素(B)取代OMVs结合的BC实验

  4、pEtN修饰的脂质A存在于mcr-1阳性大肠杆菌菌株的OMVs中

  为了评估结合粘菌素能力的差异是否是由于MCR-1酶引起的脂质A修饰所致，然后分析脂质A含量。从大肠杆菌K12和大肠杆菌50434中纯化的OMVs的脂质A被分离并用LC-MS鉴定。两种未修饰的脂质A，1或4′-磷酸(脂质A-P，m/z为1716.2)和1，4-二磷酸(脂质A-2P，m/z为1796.2)被证实存在于大肠杆菌K12和大肠杆菌50434 OMVs中。在大肠杆菌50434的OMVs中观察到连接到这些未修饰的脂质A、脂质A-P-pEtN(m/z为1839.2)和脂质A-2P-pEtN(m/z为1919.2)的单个pEtN。(图4A，B)。

  计算检测到的脂质A种类的相对量。无论是否用pEtN修饰，具有两个磷酸基团的脂质A物种都比只有一个磷酸基团更丰富(图4D)。有趣的是，与细菌细胞相比，OMVs中存在较少的pEtN修饰的脂质A，其组成分别为46%和60%(图4C)。

  这些结果证实了pEtN修饰的脂质A存在于mcr-1阳性大肠杆菌菌株的OMVs中。这可以解释为什么在相同浓度下，mcr-1阳性菌株的OMVs与mcr-1阴性菌株的OMVs相比具有减弱的保护作用。有趣的是，我们注意到细菌细胞和大肠杆菌50434的OMVs之间pEtN修饰的和天然脂质A的相对量是不相同的;未修饰的脂质A更有可能分泌到OMVs中，并且pEtN修饰的脂质A在细菌细胞中富集。

  图4 LC-MS对OMVs和生产全细胞(WC)中脂质A的表征和相对定量

  5、一株携带mcr-1基因的大肠杆菌产生了更多的OMVs

  最后，研究了mcr-1基因对OMVs产生的影响。通过亲脂性染料FM4-64的荧光测量脂质含量来确定来自大肠杆菌K12或大肠杆菌50434的OMVs的相对浓度。通过除以CFU/ml的数量来归一化OMVs的产生，并且计算相对倍数的OMVs产生，因为这些值被进一步除以对照条件的OMVs的生成。与大肠杆菌K12相比，mcr-1阳性大肠杆菌50434释放的OMVs增加了2.5倍(图5A)。对于菌株大肠杆菌50434，与不含粘菌素生长的大肠杆菌50434相比，在粘菌素压力(2 μg/ml)下生长导致OMVs产量显著增加(增加2.3倍)(图5B)。

  图5

  参考文献：Li X, Sun L, Li C, Yang X, Wang X, Hu X, Nie T, Zhang Y, You X. The Attenuated Protective Effect of Outer Membrane Vesicles Produced by a mcr-1 Positive Strain on Colistin Sensitive Escherichia coli. Front Cell Infect Microbiol. 2021 Jul 28;11:701625. doi: 10.3389/fcimb.2021.701625. PMID: 34395312; PMCID: PMC8355893.