以teicoplanin (Tcp)功能化金包覆磁铁纳米粒子(Fe3O4@Au-Tcp NPs)为捕获探针，金黄色葡萄球菌适配体(Apt)功能化银包覆金纳米粒子(Au@Ag-DTNB-Apt NPs)为信号探针，构建了一种超灵敏、双识别的表面增强拉曼散射(SERS)金黄色葡萄球菌生物传感器。采用绿色合成方法制备了Au NPs和Au@Ag NPs。本文首次报道了壳聚糖(CS)还原Au@Ag NPs的合成方法。基于Au NPs和Au@Ag NPs之间的热点效应的SERS增强，以及基于Tcp和Apt的双重识别能力，SERS生物传感器具有超灵敏和特异性。在不受其他细菌干扰的情况下，在50 min内实现了1.09 CFU mL-1的检测限和宽动态线性(7.6×101-7.6×107 CFU mL-1)。此外，SERS生物传感器可用于牛奶和橙汁样品中的金黄色葡萄球菌检测。本研究提供了一种绿色、快速、超灵敏的金黄色葡萄球菌检测方法，也探索了CS和Tcp的高利用价值，在病原菌检测中具有广阔的应用前景。

  金黄色葡萄球菌(S. aureus)是一种革兰氏阳性菌，可侵袭性感染人体几乎所有器官，引起感染性心内膜炎、皮肤软组织感染和菌血症。因此，快速检测金黄色葡萄球菌迫在眉睫。各种传统方法，如聚合酶链反应、酶联免疫吸附试验(ELISA)和质谱法，往往受到成本高、耗时长、缺乏敏感性和特异性的限制。此外，在细菌浓度较低的情况下，常规方法无法区分活菌和死菌。因此，人们建立了多种光谱方法来检测细菌，包括荧光法、比色法、共振光散射法和拉曼光谱法。

  近年来，表面增强拉曼散射(SERS)以其成本低、灵敏度高、操作简单、光谱指纹等优点备受关注，广泛应用于细菌、农药、工业化学品和有毒金属离子的检测。当拉曼分子位于贵金属表面时，发出SERS信号可因电磁场的增强而明显放大。当两个含贵金属的纳米结构之间的距离小于10 nm时，金属粒子之间电磁场的叠加将进一步形成热点效应。热点效应具有很高的SERS增强因子(107 -108个数量级)，是实现单分子检测的关键因素。研究表明，银包覆金纳米粒子(Au@Ag NPs)比常见的胶体、Au NPs和Ag NPs具有更高的SERS活性。因此，Au@Ag NPs已被用作增强NPs用于基于SERS的细菌检测。5,5′-二硫比斯-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)是一种具有两个羧基(- COOH)基团的芳香二硫化物，由于其拉曼散射截面大且不受其他荧光的干扰，常被用作拉曼分子。

  磁性纳米结构以其低毒性和高磁化率的特点在生物医学领域得到了广泛的应用。与贵金属纳米颗粒相比，磁性纳米材料更容易被氧化。此外，贵金属纳米颗粒具有良好的生物相容性和易于表面功能化的优点。许多由氧化铁和贵金属纳米颗粒组成的复合超顺磁性纳米结构已被制备出来用于生物应用。Fe3O4 NPs作为最常见的磁性材料，由于其通过磁化的快速纯化和实验步骤，在贵金属合成中得到了广泛的应用。

  壳聚糖(CS)是一种天然阳离子多糖，具有无毒、高可用性和低成本的特点，在抗菌和抗癌方面也具有优异的性能。CS由于其结构中含有大量羟基(-OH)和氨基(-NH2)基团，在聚合物合成过程中起到了很大的还原和稳定作用。此外，CS可作为还原剂和稳定剂组成Au和Ag NPs，具有明显的环保优势。

  核酸适体(Aptamer, Apt)是一种寡核苷酸片段，可特异性结合靶分子。目前，利用细菌全细胞SELEX工艺分离高亲和的Apt的研究正在蓬勃发展。除了Apt，抗生素也是识别和捕获细菌的好选择。Teicoplanin (Tcp)是一种类似万古霉素的新型糖肽类抗生素，可作为细菌检测的识别分子。Tcp中大量的亲水性基团可以形成氢键，与革兰氏阳性菌细胞壁中的丙烯丙氨酸高度相容，因此具有实现革兰氏阳性菌靶向识别的能力。此外，Tcp可以在Au NPs, Ag NPs和磁性底物上修饰，用于复杂环境下的细菌捕获。

  在此，我们报道了一种快速、超灵敏的SERS生物传感器来检测金黄色葡萄球菌。SERS生物传感器采用Tcp功能化金包覆磁铁(Fe3O4@Au-Tcp) NPs作为捕获探针，金黄色葡聚糖Apt功能化银包覆金(Au@Ag-DTNB-Apt) NPs作为信号探针。特别是捕获探针上的Au NPs和信号探针上的Au@Ag NPs通过CS的绿色还原得到，这是一种环保、易用、廉价的方法。由于捕获探针是基于Fe3O4 NPs，我们可以很容易地在形成三明治结构的过程中实现快速磁分离，即去除其他干扰物质。由于捕获探针的Tcp能够识别革兰氏阳性菌，而信号探针的金黄色葡萄球菌Apt能够特异性捕获金黄色葡萄球菌，因此SERS生物传感器具有双重识别功能。基于Au NPs与Au@Ag NPs之间的热点效应增强SERS强度，SERS生物传感器可以实现对金黄色葡萄球菌的超灵敏检测。

  图1 (A)信号探针Au@Ag-DTNB-Apt NPs的合成示意图，(B)捕获探针Fe3O4@Au-Tcp NPs的合成示意图，(C)金黄色葡萄球菌的检测过程示意图。

  在本研究中，我们成功构建了一种快速准确检测金黄色葡萄球菌的SERS生物传感器。SERS生物传感器是基于Tcp功能化金包覆纳米磁铁作为捕获探针和金黄色葡萄球菌Apt功能化银包覆金纳米磁铁作为信号探针的组合。首次成功制备了SERS生物传感器并对其进行了表征。即使在其他细菌存在的情况下，SERS生物传感器由于具有Apt和Tcp的双重识别能力，也能特异性捕获金黄色葡萄球菌并形成三明治结构。在较宽的线性范围内(7.6×101 ~ 7.6×107 CFU mL-1)，50 min内的LOD低至1.09 CFU mL-1,SERS强度具有良好的线性关系(R2 = 0.995)。该SERS生物传感器对金黄色葡萄球菌和其他细菌具有较高的选择性。SERS生物传感器可用于实际样品中金黄色葡萄球菌的检测，回收率为97.7 ~ 108.7%。

  参考文献：Qi X, Ye Y, Wang H, Zhao B, Xu L, Zhang Y, Wang X, Zhou N. An ultrasensitive and dual-recognition SERS biosensor based on Fe3O4@Au-Teicoplanin and aptamer functionalized Au@Ag nanoparticles for detection of Staphylococcus aureus. Talanta. 2022 Dec 1;250:123648.