研究背景

  目前，受限噬菌体自身局限性，噬菌体制备工艺效率低和抗菌效果不足。通过基因工程能在一定程度上提高噬菌体的抗菌效果；但是，无论是天然噬菌体还是工程噬菌体，生产工艺都具有很大的生物安全问题。例如，噬菌体依赖病原菌宿主才能扩增，生产实施需要满足病原菌培养所需安全要求，同时，对扩增后噬菌体需要进行宿主细菌毒素的去除等。因此，建立可靠安全的噬菌体生产工艺是必要的。同时，目前的噬菌体基因工程研究，依赖于宿主细胞进行扩增，导致研究效率低下。综上，作者认为建立无细胞的噬菌体生产技术具有必要性，既可实现噬菌体的安全生产，也为高效生产不同基因型噬菌体提供技术支持，从而可实现对更多未知基因的功能研究。

  摘要

  噬菌体作为对抗耐药菌手段越来越得到重视。然而，目前的噬菌体生产技术和基因工程改造技术，受限于噬菌体寄生的特点，需要针对致病性的细菌搭建相应的生产或者基因工程技术平台。因此，作者在本文中提出，建立无细胞表达体系，摆脱宿主细胞的影响。通过无细胞合成体系，作者成功实现了大肠杆菌、叶尔森氏菌、克雷伯菌等噬菌体的合成，值得注意的是，通过额外添加宿主因子，可以在原有阴性菌噬菌体合成体系中，实现革兰氏阳性菌噬菌体的合成。最后，作者利用该技术，实现了工程噬菌体的生产。表明该技术在噬菌体制备和工程改造上的潜力。

  研究结果与分析

  1、无细胞生产噬菌体方法示意图

  通过ep管中混合噬菌体DNA，细胞提取物，氨基酸和核苷酸，辅助离子，并根据噬菌体宿主不同加入不同的辅助因子，模拟宿主细胞体内环境，从而实现对噬菌体的高效生产。

  2、无细胞合成噬菌体的蛋白组表征

  作者首先通过蛋白组展示了两株噬菌体(T7和CLB-P3)在无细胞合成和天然扩增后的蛋白合成产物比较。发现，绝大部分预测的蛋白，包括假定蛋白都能被鉴定出来(其中T7鉴定出 41/57个蛋白,CLB-P3则有 68/87)，同时，无细胞合成体系的蛋白合成更稳定(图A/B中，左侧无细胞合成比右侧天然合成，鉴定出更多高表达的蛋白产物)

  3、病毒蛋白和组装的时序

  作者通过无细胞合成体系，对病毒蛋白表达和组装活性病毒颗粒的时间顺序进行研究。通过每10 min取样，进行质谱分析和裂解噬菌体分析噬菌体滴度。

  大部分蛋白都在初期就表达，只有四个蛋白(2个末端酶亚基、穿孔素和一个未知功能基因)表达时间较晚，出现在40 min后，而60min后，具有活性的病毒颗粒被检测到(图B)。同时，通过这一方法，可以分析单个不同病毒蛋白表达的时间动力学(图D)

  4、不同噬菌体的人工合成

  基于无细胞合成体系，作者尝试了对不同噬菌体的合成，包括叶尔森氏菌、克雷伯氏菌、枯草芽胞杆菌等菌的噬菌体。成功获得了高滴度的噬菌体(图A)。其中，革兰氏阳性菌噬菌体合成需要额外的转录因子sigA，作者通过共表达sigA质粒的加入，成功用大肠杆菌的无细胞表达体系制备了枯草芽胞杆菌噬菌体(B+C)。最后，作者尝试了这一方法在工程噬菌体中的应用，对噬菌体进行了荧光标记，证明了该方法在噬菌体制备和基因工程改造上应用的可能性(D+E)。

  主要结论

  1、无细胞合成体系可成功在体外合成活性大肠杆菌噬菌体，合成过程中可检测到大部分预测的噬菌体基因，包括许多假定蛋白基因，表明目前对噬菌体基因预测较准确。

  2、无细胞合成体系体外合成T7噬菌体，在60 min后可检测到活性噬菌体子代。

  3、以大肠杆菌噬菌体无细胞合成体系，可实现对不同细菌噬菌体的合成，对革兰氏阳性菌，可通过添加sigX因子而辅助合成。

  4、无细胞合成技术，可用于直接生产经过基因工程改造后的噬菌体。

  目前，噬菌体的生产制备依赖于宿主细胞，同时基因工程改造也依赖于宿主细胞体系，这限制了噬菌体的应用和发展。通过无细胞合成体系，除了制备无毒噬菌体，也可以在噬菌体基因功能研究或噬菌体工程改造上提供技术支持，使噬菌体基因编辑脱离了宿主细胞的限制，对一些宿主毒性基因功能的研究，或者在工程化改造过程中加入宿主毒性基因至噬菌体基因组中增强噬菌体抗菌效能也具有可能性。因此，建立一个有效的无细胞合成噬菌体方法，对研究噬菌体和后续应用开发具有重要的意义。