从对致病菌的战争中得到的一个重要经验是，有必要了解自然微生物群落的生理反应和进化。环境中的细菌种群通常会形成生物膜，受到某种程度的噬菌体捕食。众所周知，这些多细胞群落对抗菌素具有耐药性，因此很难根除。这引发了对新的治疗替代方案的探索，包括噬菌体疗法。

  本研究中，亚抑制剂量的philPLA-RODI噬菌体感染可促进细菌生物膜形成。

  在所有测试的MOI中，浮游阶段的细菌生长与未感染的对照组相等，直到感染后3小时，OD600值达到约0.16(图1A)。两小时后， MOI为10−2的样本显示OD600显著减少(图1A)，并且没有剩余活细胞(图1B)。这表明噬菌体导致细胞溶解。感染7小时和24小时后， MOI 为10−3和10−4时也出现同样的情况。相反，在较低MOI的所有时间点，即10−5和10−6，都可以检测到活细胞。然而，与没有噬菌体的对照组相比，MOI为10−5时，24小时生物膜存在下的浮游阶段观察到单对数减少。关于粘附相(生物膜)，与浮游相的观察结果相比有一些主要差异。有趣的是，通过结晶紫染色进行生物量定量显示，在接种MOI=10−5的样品中培养24小时后，生物膜形成显著增加(P值=0.003)(图1C)。此外，在24小时这个时间点，即使MOI为10−3也可以观察到活细胞，并且在MOI为10−5时，细胞计数没有显著减少(P值=0.107)(图1D)。在MOI为10−3时，还通过共聚焦激光扫描显微镜监测生物膜的形成。在噬菌体phiIPLA-RODI压力下的细菌生长和细胞溶解时间证实了上述观察结果。

  噬菌体存在下生物膜的溶解导致广泛的细胞溶解。

  有必要确认细胞对phiIPLA-RODI仍然敏感。为此，从对照组和感染的生物膜中取出细胞，然后再悬浮在新鲜的TSB-g培养基中，测量OD600。在实验结束时，对照样品中的OD600值翻了一番，而噬菌体感染后的生物膜样本中，细胞密度大幅降低了90%以上(图2A)。这表明处理后的生物膜中的细胞易受噬菌体感染，导致细胞溶解。因此，处理样品和对照样品之间的差异不是噬菌体抗性突变体的选择。

  在感染样本培养6小时前后，测定与细胞相关或游离于细胞外基质中的PFU数量。时间点0的噬菌体总数为106 PFU/孔，这比10 PFU/孔的初始接种量有相当大的增加(图2B)。值得注意的是，大多数病毒与细胞相连，而不是游离在细胞外基质中。在样本中，大多数感染病毒在上清液中是游离的，而只有约1%与细胞相连。鉴于观察到的高水平裂解，这一结果是可以预期的。实验结束时的总噬菌体滴度为4×109 PFU/孔，这表明已经感染的细胞有繁殖，而不仅仅是裂解(图2B)。这些结果表明，对处理过的生物膜中活细胞计数实际上可能代表未被噬菌体感染的细胞数。除此之外，生物膜群落将由一小部分但重要的病毒载体细胞组成，这些细胞在重新激活后将重启侵染循环。

  在phiIPLA-RODI亚抑制MOI剂量存在下形成的生物膜表现出结构变化。

  采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)进一步研究无噬菌体捕食的与存在MOI=10−5 的亚抑制剂量的噬菌体在24小时中生物膜之间的差异。孵育后，用SYTO®9和碘化丙啶(PI)对粘附的细胞进行染色，以区分活细胞(绿色)和受损细胞或eDNA(红色)。对照样品显示由不同层组成的典型“岛状”结构，其中大多数受损细胞(红色)位于底部附近(图3A和C)。相比之下，在有噬菌体phiIPLA-RODI的情况下的样品显示出显著不同的架构。因此，细胞覆盖了玻璃井的更大表面，但似乎组织在一个更平坦的结构中(图3B和D)。在细胞周围可以观察到一个红网样的图案，这很可能与eDNA有关。然而，与对照组相比，处理生物膜中eDNA丰度的增加仍有待证实。

  根据显微镜观察，下一步是证明噬菌体感染的生物膜富含eDNA。首先，存在于细胞外基质中的DNA是从噬菌体捕食率较低的生物膜和对照组中获得的。这些样品的琼脂糖凝胶电泳显示，在phiIPLA-RODI存在下形成的生物膜比金葡菌IPLA 1的对照生物膜中含有更多的DNA(图4A)。噬菌体捕食下形成的生物膜比未感染的生物膜对DNA酶更敏感(图4B)。事实上，对照组生物膜的生物量在2小时的DNA酶处理后几乎没有变化。相比之下，有噬菌体的生物膜中生物量减少到47%左右。这些结果表明，在低噬菌体捕食下形成的生物膜具有不同的细胞外基质，含有较大比例的eDNA。这些生物膜似乎更稳定，更好地承受结晶紫染色的洗涤步骤，从而增加附着量。

  在低水平噬菌体感染下金葡菌IPLA1生物膜表现出明显的转录特征。

  鉴于在感染和未感染的生物膜之间观察到的表型差异，辨别它们是否也表现出不同的转录谱似乎很重要。为了确定是否存在这种情况，通过RNA-seq分析了在有或没有低剂量phiIPLA RODI (10 PFU/孔，即10−5个MOI)的情况下24小时形成的生物膜的转录组。将转录组与金葡菌NCTC 8325和噬菌体phiIPLA-RODI基因组比对。在对照样品中，99%的序列与金葡菌NCTC 8325一致(图5A)。在噬菌体处理的样品中，只有51%与金葡菌参考基因组一致，另外47%与phiIPLA-RODI序列一致(图5A)。

  关于噬菌体基因表达，进一步的分析表明，最高表达的基因位于形态建成模块内(图5B，表S1)。尽管如此，在参与裂解和复制/转录的基因中也观察到显著的转录发生(图5B，表S1)。这些结果并不奇怪，因为生物膜并不反映同步感染的情况。因此，期望在噬菌体生活史的不同阶段获得被感染的细胞。

  亚抑制剂量的莫匹罗星可增加金葡菌IPLA1对噬菌体phiIPLA-RODI的抗性，但没有促进生物膜的形成。

  如上所述，噬菌体感染的生物膜显示了严格的上调反应。事实上，通过RNA-seq分析鉴定的基因中至少有7%属于这种调控子。因此，研究这一基因亚群是否在噬菌体抗性或增加生物膜形成中起作用很有趣。体外诱导这种反应的一种常见方法是暴露于抗生素莫匹罗星。为了确定严格反应是否可以作为抵抗噬菌体感染的一种防御机制，通过正交试验研究了莫匹罗星与噬菌体phiIPLA-RODI之间是否存在协同或拮抗作用。亚抑制浓度下噬菌体的存在并没有改变莫匹罗星的MIC值(0.06μg/ml)。相反，低莫匹罗星浓度导致较高的噬菌体MIC值。因此，与1/16×MIC相对应的莫匹罗星浓度导致phiIPLA-RODI的MIC增加10倍，从5×104 PFU/ml增加到5×105 PFU/ml。随着莫匹罗星浓度的增加(MIC的1/8、1/4和1/2)，对噬菌体的敏感性降低100倍(MIC=5×106 PFU/ml)。这些结果提示了噬菌体感染诱导的严格应答可能起了作用。一方面，这可能意味着细菌细胞内的噬菌体增殖会触发一种反应，防止其他噬菌体的重叠感染。这也可能是由于细菌能阻止病毒杀死细胞。在噬菌体治疗的背景下，在最小的严格反应激活条件下进行治疗似乎也可能导致更有效的生物膜消除。

  有趣的是，暴露于亚抑制浓度的莫匹罗星并没有促进生物膜的形成(数据未显示)。这表明，严格反应的上调并不是在phiIPLA-RODI存在下观察到的粘附生物量增加的主要原因。然而，不能排除由于激活严格反应而导致的主要自溶蛋白AtlA的更大表达与噬菌体裂解具有相加作用，并增强eDNA在细胞外基质中的累积。事实上，以前的报告已经证明表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌中的自溶素对于附着和形成富含DNA的生物膜的重要性。

  有更耐药的菌株时，高感染复数(MOIs)的phiIPLA-RODI也可以促进生物膜的形成。

  对金黄色葡萄球菌IPLA1细胞暴露于裂解噬菌体后形成的生物膜的研究表明，细菌种群发生了显著变化。然而，测试这种现象是否会发生在其他金黄色葡萄球菌菌株中，尤其是对噬菌体phiIPLA-RODI敏感性较低的菌株中，非常有趣。金黄色葡萄球菌IPLA15是从肉类中分离出来的，与IPLA1一样，是一种中等水平的生物膜形成菌。然而，根据最小抑菌浓度(MIC)测定(MIC为106 PFU/孔，相当于MOI为1)，该菌株对phiIPLA-RODI的抗性是1000倍。并分析亚抑制剂下噬菌体对IPLA15生物膜形成的影响。这些实验表明，当MOI为10−2时，生物膜的形成增加了3.6倍，导致菌株IPLA1的最大增加MOI高1000倍(图6)。这似乎表明噬菌体对生物膜的促进作用需要宿主菌的一定程度的感染。

  综上，本项研究表明，在非致死剂量噬菌体phiIPLA-RODI存在下形成的金黄色葡萄球菌生物膜表现出一种独特的生理状态，可能对宿主和捕食者都有潜在的好处。因此，在噬菌体压力下形成的生物膜更厚，DNA含量更高。此外，与未处理的对照相比，病毒感染的生物膜显示出重大的转录差异。

  值得注意的是，RNA-seq数据显示了严格反应的激活，这可能会减缓噬菌体在生物膜内的推进。最终的结果将是一种平衡，它将帮助细菌细胞抵御环境的挑战，同时保持一个敏感的细菌细胞库，在休眠的载体种群重新激活时可供噬菌体使用。

  DOI: 10.1038/srep40965